作者：陳武，周洪亮1王海丹1劉志輝

【摘要】 目的 采用多藥效學指標確定烏鱉顆粒中黃狗腎的提取工藝。方法 比較黃狗腎95%乙醇提取和70%乙醇提取兩種工藝對卵巢摘除大鼠雌激素活性以及對幼鼠子宮、卵巢發育的影響。結果 兩種提取工藝的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清雌二醇水平增高;95%乙醇工藝提取還具有提高大鼠雌激素活性及促進幼鼠子宮、卵巢生長的作用。結論 烏鱉顆粒中黃狗腎飲片應采用95%乙醇提取。

【關鍵詞】 烏鱉顆粒;黃狗腎;提取工藝;多藥效學指標評價

Abstract：Objective To define the extraction process of Dog Penis in Wubie Granules by multiple pharmacodynamics indicators. Methods Rat ovaries were removed by operation. The effect of 95% alcohol extraction and 70% alcohol extraction were compared on uterus and ovaries development of immature mice and estrogen activity of rats with operation. Results Products of both processes could raise E2 level in serum of rats with operation， 95% alcohol extraction could also enhance estrogen activity of rats and develop uterus and ovaries of immature mice. Conclusion Dog Penis in Wubie Granules should be extracted by 95% alcohol.

Key words：Wubie Granules;Dog Penis;extraction process;multiple pharmacodynamics index evaluation

烏鱉顆粒來源于江蘇省中醫院名老中醫夏桂成教授臨床經驗方，由黃狗腎、制何首烏和鱉甲等7味藥組成，臨床上用于治療卵巢功能早衰。黃狗腎為犬科動物狗Canis familiaris L.的干燥陰莖和睪丸，具有暖腎、壯陽、益精功效[1]。目前黃狗腎文獻報道比較少，物質基礎研究薄弱，有效成分尚不明確，為保證制劑療效，筆者采用多藥效學指標評價方法對黃狗腎提取工藝進行探索。

1 實驗材料

1.1 動物

雌性SD大鼠，體重120～140 g，由浙江大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(浙)2008-0033。ICR小鼠，體重14～18 g，由揚州大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(蘇) 2007-0001。

1.2 儀器

SP-756PC型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);LDZ5-2型離心機(北京京立離心機有限公司);r-911全自動放免計數儀(中國科技大學實業總公司);FA1004電子分析天平(上海精科天平廠)。

1.3 藥物與試劑

六味地黃丸(河南宛西制藥股份有限公司，批號090872)。黃狗腎及方中飲片均購于江蘇省醫藥公司，經鑒定符合相關要求。紅四氮唑(TTC，上海試劑三廠，批號961115);四氯乙烯(中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號20010203);無水乙醇(上海久億化學試劑有限公司，批號20090210)。雌二醇(E2)試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號20091128);促卵泡激素(FSH)試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號20091128);黃體生成素(LH)試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號20091128)。

2 方法與結果

2.1 供試液制備方法

工藝A提取液：按處方比例稱取飲片，黃狗腎加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次1 h，濾過，藥液與藥渣備用;枸杞子、茯苓加10倍量水煎煮2次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.20(60 ℃測)的浸膏，備用;黃狗腎藥渣與方中其他飲片加10倍量水煎煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度1.15(80 ℃測)，加乙醇至含量為60%，靜置48 h，抽濾，濾液與黃狗腎液合并回收乙醇至盡，再與枸杞子、茯苓提取液合并即得。

工藝B提取液：按處方比例稱取飲片，黃狗腎加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，濾過，藥液與藥渣備用;其余6味飲片的處理同工藝A。

陽性對照液：取六味地黃丸搗碎，研成粉狀，然后加入蒸餾水混溶，即得。

陰性對照液：按處方比例稱取飲片(缺黃狗腎)，飲片的處理同工藝A。

2.2 統計學方法

數據用—(—用)±s表示，采用t檢驗，用SPSS11.0統計軟件進行統計分析。

2.3 對卵巢摘除大鼠雌激素活性的影響

取雌性SD大鼠85只，除正常對照組10只外，其余75只去除雙側卵巢，手術后2周，將手術成功的大鼠隨機分組，每組10只。各組按下述劑量每日灌胃給予相應藥物1次，正常對照組和模型組：等量生理鹽水;陽性對照組：3 g/kg六味地黃丸;工藝A組：11 g/kg;工藝B組：11 g/kg;陰性對照組：11 g/kg。每日灌胃1次，連續給藥4周。末次給藥30 min后，每鼠陰道內緩緩注入新鮮配制的25 mg/mL TTC水溶液0.1 mL，于陰道內停留30 min，取血，離心，取血清測E2、FSH、LH水平。立即處死，剪取大鼠陰道，縱行切開，分離陰道，剪碎后置離心試管中，加入無水乙醇和四氯乙烯混合溶液4 mL，浸泡提取2 h， 2 000 r/min離心5 min。吸取上清液，以無水乙醇和四氯乙烯混合液作空白對照，于490 nm處測定A值[2-4]。

結果表明，工藝A組和工藝B組均可使卵巢摘除大鼠血清E2水平增高，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。提示工藝A組和工藝B組具有調節機體激素水平的作用。工藝A組的OD值與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，提示工藝A組可明顯增加大鼠陰道角化上皮細胞，具有提高雌激素活性的作用。見表1、表2。表1 對卵巢摘除大鼠血清E2、FSH、LH活性的影響(—(—的)±s)表2 對卵巢摘除大鼠雌激素活性的影響(—(—巢)±s)

2.4 對幼鼠子宮、卵巢發育的影響

取未成熟ICR健康雌性幼鼠(體重14～18 g)60只，隨機分為空白對照組(灌胃等量生理鹽水)、陽性對照組(4.5 g/kg)、工藝A組(16.5 g/kg)、工藝B組(16.5 g/kg)、陰性對照組(16.5 g/kg)。各組均灌胃給予相應藥物，劑量0.2 mL/10 g， 1次/d×10 d。末次給藥后12 h，脫頸椎處死，解剖，取子宮、卵巢、脾、胸腺，分離脂肪，迅速以電子天平稱重。計算脾、胸腺、卵巢、子宮系數 [2]。結果表明，工藝A組促進子宮、卵巢和胸腺生長，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)。提示工藝A組具有促進子宮、卵巢發育的作用。見表3。表3 對幼鼠子宮、卵巢、脾、胸腺發育的影響(—(—鼠)±s)

3 討論

鞭類中藥飲片的服用方法主要包括研粉吞服、煮食和泡酒內服。譚氏等[5]研究結果表明，狗鞭(黃狗腎)飲片勻漿后的混懸液對腎陽虛型動物有不同程度的壯陽作用;文獻報道其主要含雄性激素、蛋白質、維生素E、脂肪和有機纖維等成分[6]。

本試驗結果表明，烏鱉顆粒中黃狗腎不同乙醇濃度提取工藝(工藝A和工藝B)的提取物均可使卵巢摘除大鼠血清E2水平增高;此外，用95%乙醇提取工藝(工藝A)制備的提取物還具有較好的提高大鼠雌激素活性，促進子宮、卵巢生長的作用，這與烏鱉顆粒治療卵巢功能早衰目的一致。綜合上述分析，方中黃狗腎飲片應用95%乙醇提取。

提取黃狗腎所用乙醇濃度不同，對藥效的影響也不同，濃度高者藥效明顯好，這是否提示黃狗腎中極性較低的成分是其有效成分，有待進一步研究。