作者：王祥培，吳紅梅，王祥森，劉霞

【摘要】 目的對不同采收期頭花蓼藥材進(jìn)行指紋圖譜相似度評價(jià)，探索最佳采收期。方法用RP-HPLC(DAD)法，梯度洗脫，測定不同采收期頭花蓼的指紋圖譜，并作相似度比較分析。結(jié)果不同采收期頭花蓼的指紋圖譜有明顯差異。結(jié)論應(yīng)注意不同采收季節(jié)對頭花蓼藥材的質(zhì)量影響。

【關(guān)鍵詞】 頭花蓼藥材; HPLC指紋圖譜; 相似度

頭花蓼為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Han.ex D.Don的干燥全草或地上部分，具有清熱利濕，解毒止痛，活血散瘀以及利尿通淋之功效，主治泌尿系統(tǒng)感染、血尿、濕疹、腎盂腎炎等癥[1]。目前測定不同產(chǎn)地、不同采收期頭花蓼藥材中化學(xué)成分的含量已有研究報(bào)道[2～5]，但頭花蓼化學(xué)成分復(fù)雜，并且隨著采收期的不同存在差異。因此，為了更全面評價(jià)頭花蓼藥材質(zhì)量和控制質(zhì)量的穩(wěn)定性，本文對不同采收期共15批頭花蓼藥材進(jìn)行了高效液相指紋圖譜研究，并采用國家藥典委員會(huì)推薦使用的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2004A)”對不同采收期頭花蓼藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，并以相似度數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，以期為頭花蓼最佳采收期的確定提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料采自西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn)，共15批，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院王祥培副教授鑒定為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。具體見表1。沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0638-9501)，槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：081-90003)，槲皮苷對照品(自制，純度﹥98%);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸鎦水。

1.2 儀器Agilent1100型高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣品)，二極管陣列檢測器(DAD);《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版》(國家藥典委員會(huì))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用依利特Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，乙腈-0.4%磷酸二元梯度洗脫，體積流量：0.8 ml/min，檢測波長：310 nm，柱溫25℃。

2.2 流動(dòng)相條件[6]0～5 min：乙腈 0%～5%，0.4%磷酸 100%～95%;5～55 min：乙腈 5%～25%，0.4%磷酸 95%～75%;55～70 min：25%～30%，0.4%磷酸 75%～70%;70～80 min：乙腈 0%，0.4%磷酸 100%;80～85 min：乙腈 0%，0.4%磷酸 100%。

2.3 供試品溶液的制備[6]取頭花蓼細(xì)粉(3號篩)2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加100 ml 80%乙醇，置水浴中加熱回流2 h，濾過，殘?jiān)?00 ml 80%乙醇回流提取1 h，濾過，合并濾液。濾液置蒸發(fā)皿中揮干，殘?jiān)?0%乙醇定容置10 ml容量瓶中。用微孔濾膜(0.45 μm) 濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、槲皮素和槲皮苷對照品適量，加50%甲醇溶解分別制成0.031 5，0.028 1和0.061 3 mg/ml 的溶液，即得。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察[6]

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)取同一份供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得各共有色譜峰相對留時(shí)間及相對峰面積的RSD均低于3%，表明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別在0，2，6，12，20，30 h進(jìn)行檢測，測得各共有色譜峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均低于3%，表明樣品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一采收期的供試品5份，精密稱量，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測得各共有色譜峰相對留時(shí)間及相對峰面積的RSD均低于3%，表明重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜建立 精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件，進(jìn)行檢測。同一實(shí)驗(yàn)條件下，測定所有供試品HPLC色譜圖。根據(jù)不同采收時(shí)間供試品測定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值(積分值)和峰位(相對保留時(shí)間)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜，見圖1。圖1 不同采收期頭花蓼藥材指紋圖譜

2.7 指紋圖譜分析[6]

2.7.1 共有指紋峰標(biāo)定 比較不同采收期頭花蓼供試品溶液給出的相關(guān)參數(shù)，其中13個(gè)峰是各批供試品共有，因此確定這13個(gè)峰為其共有指紋峰，其中槲皮苷峰較沒食子酸峰及槲皮素峰大，選作為參照峰。

2.7.2 頭花蓼指紋圖譜相似度評價(jià) 將15個(gè)不同采收期頭花蓼樣品測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，經(jīng)選峰，設(shè)定匹配模板，將峰自動(dòng)匹配，然后設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行譜峰差異性評價(jià)和整體相似性評價(jià)。通過中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件得出頭花蓼HPLC指紋圖譜共有模式，與共有模式比較，15批次不同采收期頭花蓼藥材的相似度結(jié)果見表1。

2.8 頭花蓼HPLC指紋圖譜相似度的分類研究 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對15個(gè)樣品的指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果見圖2。從聚類分析結(jié)果可以看出，系統(tǒng)將15個(gè)樣品分為2大組，2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14為一組，其中4，11，3，12，13為一小組，2，7，8，9，10，14為另一小組，1，5，6，15為一組，說明不同采收期頭花蓼藥材分為2大類，其中以1～4月采收的為一大類，5～12月的為一大類，但9～11月為一小類，5～8月為一小類。表1 不同采收期頭花蓼藥材相似度結(jié)果編號 產(chǎn)地 采收時(shí)間 相似度 1 西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200503 0.351 2西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200508 0.897 3西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200509 0.963 4西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200510 0.954 5西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200703 0.3716西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200704 0.4657西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200705 0.8248西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200706 0.8519西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200707 0.89110西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200708 0.89911西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200709 0.95512西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200710 0.96813西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200711 0.98114西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200712 0.85215西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn) 200801 0.6211-2005.03，2-2005.08，3-2005.09，4-2005.10，5-2007.03，6-2007.04，7-2007.05，8-2007.06，9-2007.07，10-2007.0811-2007.09，12-2007.10，13-2007.11，14-2007.12，15-2008.01圖2 15批頭花蓼HPLC指紋圖譜相似度聚類譜系圖

3 討論

本文對西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn)同一產(chǎn)地的不同采收期頭花蓼藥材進(jìn)行指紋圖譜相似度及其系統(tǒng)聚類分析，研究結(jié)果顯示1～4月份采收的頭花蓼指紋圖譜相似度較低并歸為一大類，5～12月份采收的頭花蓼指紋圖譜相似度較高，歸為一大類，其中 9～11月份采收的頭花蓼指紋圖譜相似度最高，從不同采收期頭花蓼藥材相似度評價(jià)結(jié)果和筆者對采收到的藥材性狀來看，建議頭花蓼藥材采收應(yīng)在5～12月份。研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[5]的基本相符，與 2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中稱頭花蓼春、夏、秋三季采收有一定的差異。