【摘要】 目的 優(yōu)選桂枝甘草湯方藥成分提取時(shí)藥材的最佳組合方式。方法 將方藥分成混煎組和桂枝、甘草單煎混合組，用半仿生提取法提取，提取液作甘草次酸、肉桂酸、總黃酮、揮發(fā)油、干浸膏的含量測(cè)定及50%乙醇精制液的HPLC指紋圖譜比較。結(jié)果 除干浸膏2種組合提取液含量相近外，其余4個(gè)指標(biāo)成分含量混煎液均明顯高于單煎混合液；2種組合提取液的HPLC指紋圖譜無(wú)明顯差異；HPLC梯度洗脫總積分面積及主要特征峰峰面積：混煎液＞單煎混合液。結(jié)論 桂枝甘草湯方藥成分提取時(shí)以桂枝與甘草混煎為佳。

【關(guān)鍵詞】 桂枝甘草湯；半仿生提取法；甘草次酸；肉桂酸；黃酮化合物；揮發(fā)油；指紋圖譜

Abstract：Objective To optimize the best ingredients combination of Guizhi Gancao Decoction. Method The prescription was put into two groups， and extracting by semi-bionic extraction. The contents of Glycyrrhetinic acid， Cinnamic acid， total flavones， volatile oil and dry extract in the each extract were determined， and HPLC fingerprint of the refined by 50% ethanol was compared. Results Except the similar content of dry extract in two kinds of combinations， the other four index components in mixed extract is significantly higher than inpidual extraction. Two kinds of combinations extract fingerprints of the HPLC had no significant difference. HPLC gradients eluting total score area and main characteristic peak area in mixed extract were higher than inpidual extraction. Conclusion It is better that Guizhi Gancao Decoction extracted with Guizhi and Gancao mixed. Key words：Guizhi Gancao Decoction；semi-bionic extraction；Glycyrrhetinic acid；Cinnamic acid；total flavones；volatile oil；HPLC fingerprint 桂枝甘草湯出自漢代張仲景的《傷寒論》，由桂枝、炙甘草組成，具有補(bǔ)心助陽(yáng)、生陽(yáng)化氣、補(bǔ)陽(yáng)扶中的功效。臨床用于心率失常具有較好效果。有研究表明，桂枝甘草湯對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)的姐妹染色體互換及微核升高具有較強(qiáng)的抑制作用[1-2]。但目前桂枝甘草湯的應(yīng)用仍以湯劑為主，方藥的提取多采用水提法，存在揮發(fā)性成分易損失、易霉變、服用不便等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)在用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選出桂枝甘草湯半仿生提取法(簡(jiǎn)稱(chēng)SBE法)工藝條件的基礎(chǔ)上，將方中藥材組合成2組，用優(yōu)選出的SBE法工藝條件提取，提取液作甘草次酸、肉桂酸、總黃酮、揮發(fā)油、干浸膏的含量測(cè)定及50%乙醇精制液的HPLC指紋圖譜比較，優(yōu)選出桂枝甘草湯方藥提取時(shí)藥材的最佳組合方式。

1 儀器與試藥

LC-10A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；PHS-3C型精密PH計(jì)(上海雷磁儀器廠(chǎng))；FA1004型電子分析天平(上海第二分析儀器廠(chǎng))；LXV-Ⅱ型離心沉淀機(jī)(上海第二分析儀器廠(chǎng))；KQ-250E型醫(yī)用超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；色譜柱：phenomenex ODS3(5 μm，4.6 mm×150 mm)；SPD-10Avp紫外檢測(cè)器；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))。 藥材經(jīng)鑒定，桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝，甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖。炙甘草：取煉蜜，加適量開(kāi)水稀釋后，淋入凈甘草片中拌勻，悶潤(rùn)，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至老黃色，不粘手時(shí)取出，放涼(每100 kg甘草用煉蜜25 kg)。 甘草次酸、肉桂酸、柚皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為723-200109、710-200011、722-200107)；甲醇為色譜純；水為三蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的組合方式

將桂枝、甘草排列組合成2組，即單煎混合組和混煎組。混煎組為桂枝、甘草合煎；單煎混合組為桂枝、甘草分別單煎后合并2種濃縮液。

2.2 提取液的制備

將處方藥材分別粉碎，過(guò)10～20目篩，按處方比例(桂枝∶甘草＝2∶1)分別稱(chēng)取桂枝粗粉80 g、炙甘草粗粉40 g，按“2.1“項(xiàng)下組合方式，用SBE法分別提取3次(雙提法：第1次用水用0.1 moL/L HCl調(diào)至pH為2.04，第2、3次用水用0.1 moL/L NaOH調(diào)至pH為7.25、8.51；加水量依次為藥材重量的10、8、8倍；煎煮時(shí)間依次為190、95、45 min；雙提法提取的揮發(fā)油單獨(dú)存放)，分別濾過(guò)，離心，合并上清液，水浴濃縮至400 mL。同法制備甘草、桂枝單煎液，即得(每1mL相當(dāng)于原藥材0.3 g)。

2.3 供試液的制備

精取提取液各10 mL，加水35 mL，緩緩加入鹽酸4 mL，靜置30 min，待氣泡消失后，再加鹽酸1 mL、氯仿30 mL，水浴加熱回流1.5 h，放冷，移至分液漏斗中，靜置，分取氯仿層，水層用氯仿萃取(20 mL×2)，回收氯仿，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇定容至25 mL，得供試液A(每1mL相當(dāng)于原藥材0.12 g)。

精取提取液各15 mL，分別置蒸發(fā)皿中，加硅藻土4 g，拌勻，水浴蒸至近干，80 ℃烘干，研細(xì)，加乙酸乙酯40 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，回收乙酸乙酯，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，得供試液B(每1mL相當(dāng)于原藥材0.9 g)。

精取提取液各15 mL，分別置蒸發(fā)皿中，加硅藻土4 g，拌勻，水浴至近干，80 ℃烘干，研細(xì)，用甲醇100 mL索氏回流5 h(提至無(wú)色)，濾過(guò)，用甲醇定容至100 mL，得供試液C(每1 mL相當(dāng)于原藥材0.045 g)。

精取提取液各15 mL，分別置蒸發(fā)皿中，加硅藻土4 g，拌勻，水浴蒸至近干，80 ℃烘干，研細(xì)，用50%乙醇100 mL索氏回流4 h (提至無(wú)色)，濾過(guò)，用甲醇定容至100 mL，得供試液D(每1 mL相當(dāng)于原藥材0.045 g)。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取甘草次酸對(duì)照品1.70 mg，用無(wú)水乙醇配制成0.34 mg/mL的溶液。精密稱(chēng)取肉桂酸對(duì)照品2.20 mg，用甲醇配制成0.22 mg/mL的溶液。精密稱(chēng)取甘草酸銨對(duì)照品1.60 mg，用50%乙醇配制成0.32 mg/mL的溶液。精密稱(chēng)定柚皮苷對(duì)照品2.00 mg，用甲醇配制成1.00 mg/mL的溶液。

2.5 甘草次酸含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫：35 ℃；靈敏度：1.0AUFS；流動(dòng)相：甲醇-水(84∶16)；流速：1.00 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，甘草次酸與其他成分可達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)1 981。

2.5.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

精取甘草次酸對(duì)照液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別用無(wú)水乙醇定容至1 mL，各取20 μL進(jìn)樣，按“2.5.1”項(xiàng)下條件依法測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果甘草次酸在0.68～6.8 μg范圍內(nèi)，其質(zhì)量(μg)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程：Y＝1.008 434×106X＋104 180，r＝0.999 2。

2.5.3 樣品含量測(cè)定

取供試液A，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，精取濾液各20 μL，進(jìn)樣，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖1。表1 2種組合提取液中甘草次酸的含量測(cè)定結(jié)果(略)注：與單煎混合液比較，☆☆☆P＜0.001

2.6 肉桂酸含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm；柱溫：35 ℃；靈敏度：1.0 AFUS；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(52∶48)；流速：1.00 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，肉桂酸與甘草次酸均可達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)2 778。

2.6.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

精取肉桂酸對(duì)照液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，分別加甲醇定容至1 mL，各取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果肉桂酸在0.11～0.44 μg范圍內(nèi)，其質(zhì)量(μg)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程：Y＝7.467 7×106X＋123 315.29，r＝0.999 8。

2.6.3 樣品含量測(cè)定

取供試液B，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)， 進(jìn)樣20 μL，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，色譜圖見(jiàn)圖2。表2 2種組合提取液中肉桂酸的含量測(cè)定結(jié)果(略)注：與單煎混合液比較，☆☆P＜0.01

2.7 總黃酮含量測(cè)定

2.7.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

精取柚皮苷對(duì)照液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，加入甲醇1 mL，再加入10%KOH溶液0.5 mL，室溫放置5 min，用甲醇稀釋并定容至10 mL，以甲醇作空白對(duì)照，在412 nm處測(cè)定吸收度。以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果總黃酮的線(xiàn)性范圍為20～100 μg/mL，回歸方程：A＝0.052 17C－0.019 7，r＝0.996 4。

2.7.2 樣品含量測(cè)定

精取供試液C各4 mL，用甲醇稀釋并定容至100 mL。取上述稀釋液1 mL，加10%KOH溶液0.5 mL，室溫放置5 min，用甲醇稀釋至10 mL，在412 nm處測(cè)定吸收度。另取上述稀釋液1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，作為空白對(duì)照。總黃酮的含量以柚皮苷計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。表3 2種組合提取液中總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果(略)注：與單煎混合液比較，☆☆P＜0.01

2.8 干浸膏得量測(cè)定

精取“2.2”項(xiàng)下提取液各10 mL，分別置恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，烘至恒重，計(jì)算干浸膏得量，結(jié)果見(jiàn)表4。表4 2種組合提取液中干浸膏得量測(cè)定結(jié)果(略)

2.9 揮發(fā)油的含量測(cè)定

按2005年版《中華人民共和國(guó)藥典》(二部)附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)[3]測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。表5 2種組合提取液中揮發(fā)油的含量測(cè)定結(jié)果(略)注：與單煎混合液比較，☆P＜0.05

2.10 HPLC指紋圖譜比較

2.10.1 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫：35 ℃；靈敏度：1.0 AFUS；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸；甲醇(5%)4 min，甲醇(28%)→甲醇(52%)11 min，甲醇(52%)→甲醇(84%)10 min，甲醇(84%)→甲醇(100%)10 min；流速：1.00 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.10.2 HPLC圖譜的測(cè)定比較

取供試液D分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。結(jié)果總峰面積：?jiǎn)渭寤旌弦簽? 215 519，混煎液為13 299 913。以保留時(shí)間15.190 min色譜峰的保留時(shí)間為1.0，計(jì)算2種組合提取液的主要特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果2種組合提取液中主要特征峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致。主要特征峰的峰面積見(jiàn)表6，色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。表6 HPLC圖譜中主要特征峰的峰面積（略）

HPLC指紋圖譜顯示，在此分析范圍內(nèi)，2種組合提取液的色譜峰數(shù)及峰位基本一致，說(shuō)明二者的成分基本一致。主要特征峰的總峰面積：混煎液＞單煎混合液，尤以3、10號(hào)峰峰面積相差較大。主要特征峰占總峰面積比例，單煎混合液為52.68%，混煎液為58.63%，二者差別不大。

3 小結(jié)與討論

我們將桂枝甘草湯方藥組合成2組，用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選出的SBE法工藝條件進(jìn)行提取，提取液作甘草次酸、肉桂酸、總黃酮、揮發(fā)油、干浸膏的含量測(cè)定及50%乙醇精制液HPLC指紋圖譜比較。結(jié)果除干浸膏含量單煎混合液與混煎液相近外，其余4個(gè)指標(biāo)成分的含量，混煎液均明顯高于單煎混合液。其中甘草次酸、肉桂酸的含量，混煎液分別是單煎混合液的2.53和1.88倍。2種組合提取液HPLC指紋圖譜無(wú)明顯差異。HPLC梯度洗脫總峰面積及主要特征峰峰面積：混煎液＞單煎混合液。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為桂枝甘草湯方藥成分提取時(shí)以桂枝、甘草混合提取為佳。本結(jié)果表明，2種組合水提取液中甘草次酸、肉桂酸、總黃酮、揮發(fā)油含量，混煎液明顯高于單煎混合液，說(shuō)明桂枝與甘草配伍后利于其有效成分的溶出，同時(shí)也說(shuō)明古方將二者配伍入湯劑是有其科學(xué)道理的。