【摘要】 目的： 介紹藥物體外肝代謝方法的最新進展. 方法： 根據近幾年的文獻資料進行分析、綜合、歸納. 分別按肝微粒體體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、肝勻漿體外孵育法進行介紹. 結果：體外肝代謝研究方法發展迅速. 結論： 目前主要的藥物體外肝代謝方法各有利弊，但對于新藥開發來都是必不可少的研究手段.

【關鍵詞】 肝 代謝;微粒體，肝;肝細胞;藥代動力學

0 引言

肝臟是藥物主要的和重要的代謝器官，是藥物生物轉化的主要場所，是富含參與藥物代謝的一個龐大的依賴細胞色素P450的混合功能氧化酶系統，大多數藥物的Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應都是在肝藥酶系統的參與下發生的，因此藥物的體外代謝模型主要是以肝臟為基礎的，并以其特有的優勢和特點在藥物代謝的研究中得到廣泛的應用. 體外藥物的肝代謝研究已經發展很長時間，與體內代謝研究相比，體外代謝研究有許多優點，①體外代謝研究可以排除體內諸多的干擾因素，直接觀察到代謝酶對底物的選擇性代謝，為體內代謝研究提供重要的線索和依據. ②對于體內代謝轉化率低且缺乏靈敏檢測手段的藥物來說，體外代謝不失為一種很好的研究手段. ③體外代謝研究具有快速簡便的特點，適合大量化合物的藥動學篩選. ④不需要消耗大量的樣品和實驗動物，因而研究費用相對較低［1］. 我們從體外肝代謝模型入手，綜述了近年來藥物體外肝代謝的文獻.

1 肝微粒體體外溫孵法

肝微粒體體外溫孵實驗是采用從肝臟中提取的肝微粒體，并加入還原型輔酶II(NADPH)再生系統，在體外模擬生理環境下進行代謝反應，采用高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜質譜聯用法(HPLCMS)等測定方法對原型藥及代謝產物進行測定的一種體外代謝的實驗方法.

1.1 Ⅰ相代謝 Ⅰ相代謝又稱為官能團反應，包括氧化、還原、水解、水合等反應. NADPH為還原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，是許多藥物生物轉化反應中不可缺少的輔助因子，它在這些反應中起到還原劑的作用，體系中只要NADPH濃度達到1 mmol/L時，便足以維持藥物代謝反應進行，但NADPH價格較高，且不易長時間保存. 因此常采用NADPH再生系統來代替NADPH. 即利用相對穩定和廉價的輔酶II(NADP)與6磷酸葡萄糖在6磷酸葡萄糖脫氫酶的作用下生成NADPH. 6磷酸葡萄糖＋NADP 6磷酸葡萄糖脫氫酶

6－磷酸葡萄糖內脂＋NADPH 文獻［2］研究了吡喹酮在大鼠肝微粒體內的代謝情況，發現在不同誘導劑對大鼠肝微粒體誘導后其羥基化代謝產物不同. 姚慶強等［3］則利用大鼠肝微粒體溫孵實驗對黃皮酰胺的正反異構體的代謝情況進行了考察，并采用HPLCMS對其代謝產物進行定性和定量，發現右旋和左旋的黃皮酰胺均代謝產生3去氫黃皮酰胺. 姜敏等［4］應用CYP3A特異性誘導劑地塞米松、CYP2B誘導劑苯巴比妥、CYP1A誘導劑β－萘黃酮分別對Wister大鼠進行在體誘導， 建立肝微粒體溫孵及NADPH再生體系， HPLC紫外檢測法測定. 研究結果提示甲基蓮心堿具有酶促動力學代謝特性; CYP3A及CYP2B是介導甲基蓮心堿在大鼠體內生物轉化的CYP450亞酶， 其中主要參與甲基蓮心堿代謝的為CYP3A. 王汝濤等［5］研究了染料木黃酮在大鼠肝微粒體代謝的酶動力學，研究發現CYP1A2 參與了染料木黃酮的代謝， CYP1A2 的抑制劑可能會與染料木黃酮發生代謝相互作用， 從而降低染料木黃酮的代謝速率. 曹露曄等［6］研究了藍萼甲素在大鼠體內外的代謝轉化，發現藍萼甲素在大鼠肝微粒體和膽汁中可被代謝轉化， 主要代謝產物為羥基化藍萼甲素. Sung等［7］研究了KR60436（一種鈉鉀ATP酶抑制劑）在大鼠和人肝微粒體中的代謝情況，發現在兩種微粒體中KR60436可產生7種氧化代謝產物，其中4種為氧化代謝產物. Anne等［8］采用大鼠和人肝微粒體孵育體系，對rhazinilam進行體外孵育，發現其在大鼠肝微粒體中可被氧化為3種代謝產物，并確定CYP2B6為主要的藥物代謝酶.

1.2 Ⅱ相代謝 Ⅱ相代謝又稱結合反應，包括糖苷結合、硫酸化、甲基化、乙酰化等反應. 一般認為Ⅰ相反應使藥物產生或去掉一個基團，從而使Ⅱ相反應得以發生. 因此Ⅱ相反應是真正的解毒途徑，它大部分生成藥物的非活性形式而排除體外. 目前采用肝微粒體體外孵育反應主要集中在藥物的葡醛酸化反應，通過肝微粒體與UDPGA孵育得到該藥物的葡醛酸化結合物，并考察其酶動力學. 欒連軍等［9］用高效液相色譜法分離測定大鼠肝微粒體中普萘洛爾葡醛酸化代謝產物，通過體外孵育得到外消旋普萘洛爾兩種對映體的葡醛酸化代謝產物. 采用不同誘導劑對大鼠肝微粒體誘導后，采用體外孵育的方法，對氧氟沙星對映體葡醛酸化代謝進行研究，結果表明不同誘導劑誘導的大鼠肝微粒體對氧氟沙星對映體代謝有明顯的影響. 裘雅漁等［10］對大鼠肝微粒體體系中銀杏萜內酯代謝進行考察，通過HPLCELSD對銀杏萜內酯剩余量的測定，考察其酶動力學，結果表明，銀杏萜內酯在該體系下代謝較慢. Sabine等［11］對幾種短鏈的脂肪醇葡醛酸化代謝進行研究，采用人肝微粒體孵育體系，并采用GCMS進行測定，同時測定其酶動力學. 結果發現，對于短鏈脂肪醇來說，不止一種Ⅱ相代謝酶催化其代謝反應. Rangaraj等［12］研究了氟派啶醇在大鼠肝微粒體的葡醛酸化反應，并采用HPLC/MS/MS測定. 結果表明，Ⅱ相代謝酶UGT2B12，UGT 2B1為該藥物的主要催化酶.

2 肝細胞體外溫孵法

肝細胞體外孵育法與肝微粒體法相似，即以制備的肝細胞輔以氧化還原輔酶，在模擬生理環境條件下進行代謝反應的體系. 培養體系中的肝細胞可以很好地模擬體內肝臟的生理環境， 在研究外源性化合物的生物活性、毒性、毒理機制、代謝命運和致癌性檢測等方面有許多優勢， 被認為是藥物臨床前毒性檢測的可靠模型［ 13 ］. Born等［14］利用新鮮分離的鼠肝細胞檢測了香豆素的代謝產物， 發現香豆素經肝細胞代謝產生的香豆素環氧化物和該環氧化物的代謝產物0羥苯乙醛是引起肝毒性的主要原因. Yoshihiro等［15］利用新鮮分離的肝細胞考察了十幾種化合物的體外清除率， 并與體內血漿清除率比較， 發現兩種方法一致性較好， 在藥物研發中有很好的應用前景. 曹國穎等［16］考察了那格列奈在大鼠游離肝細胞中的代謝特點，結果表明CYP450同工酶CYP2D6和CYP2C9在那格列奈羥基化過程中起重要作用.

3 肝勻漿體外溫孵法

上述采用的體外肝代謝都比較復雜，操作比較煩瑣，因此目前很多研究人員為了簡化實驗，直接采用將肝臟勻漿的辦法，將藥物加入到肝勻漿溶液中，考察其在肝勻漿液的代謝情況來說明藥物在肝臟中的代謝情況. 陳聰穎等［17］將槐苷在大鼠肝勻漿液中孵育，采用RPHPLC法測定槐苷及其代謝產物. 研究表明，其主要代謝產物為苷元. 李文蘭等［18］研究了鄰苯二甲酸丁基芐酯在不同性別小鼠肝勻漿中的生物降解. 結果表明，鄰苯二甲酸丁基芐酯在肝臟中代謝有明顯的性別差異. 陳懷俠等［19］采用液相色譜－串聯質譜法分析大鼠山莨菪堿肝勻漿代謝物. 結果在大鼠肝勻漿培養液中發現了脫水山莨菪堿，說明山莨菪堿在大鼠肝臟中可以被代謝. 呂承等［20］將燈盞乙素與的家兔小腸內容物、肝組織勻漿和血漿在37℃孵育. 結果表明燈盞乙素體外不穩定， 在生物樣品中降解迅速， 肝臟、血液、小腸等都是燈盞乙素可能的降解部位. 林文輝等［21］研究了布洛芬離體肝代謝中對映體間的相互作用，發現在手性轉化代謝過程中存在對映體的相互作用， 即S (+)－布洛芬可以抑制R (-)－布洛芬的轉化.

4 結語

綜上所述， 常用的體外肝代謝研究方法有肝微粒體體外孵育法、肝細胞體外孵育法及肝勻漿體外孵育法. 這三種方法各有利弊，其中肝微粒體體外孵育法在體外肝代謝研究中應用最為廣泛. 該方法與其他體外肝代謝相比，具有酶制備技術簡單、代謝過程快、結果重現性好、易于大批量操作等優點，但該法所得的結果與體內代謝的一致性方面存在不足，需要體內代謝結果的驗證. 而肝細胞體外孵育法主要應用在藥物的體外代謝清除率方面，但肝細胞制備技術比較復雜，同時制備好的肝細胞在體外的活性只能維持4h，不利于儲存和反復使用. 肝勻漿體外孵育法是一種最簡單的體外肝代謝孵育方法，具有制備簡單、實驗時間短等優點，但由于在肝勻漿液中各種酶比較復雜，因此對于樣品處理及測定方法來說干擾比較大，而且肝勻漿液很容易失活，這也是其應用不太廣泛的原因之一. 除了上述三種主要體外肝代謝方法外，還有肝組織切片法，該方法的優點在于可以保留所有的肝藥酶及細胞器的活性，對于某些藥物代謝研究來說，有時采用肝組織切片技術比肝微粒體孵育更好. 但由于該技術需要切片機等特殊的設備，因此近年來已經很少被采用. 總之，藥物的體外肝代謝作為考察藥物代謝的技術之一，隨著時間的推移在今后會越來越受到人們的重視，必將成為藥物代謝領域里必不可少的組成部分.

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