作者：白寶星 張春燕 田敏 朱輝

【摘要】 突變生物合成作為產生抗生素衍生物的重要手段，自20世紀70年代興起以來，發揮了巨大作用，已開發出許多至今在臨床上仍廣泛使用的抗生素品種。隨著基因技術的發展，突變生物合成技術可直接對次級代謝途徑中一特定酶基因進行改造獲得突變株，大大提高了工作效率和準確性。本文綜述了突變生物合成技術在微生物藥物領域的應用，特別是結合基因技術進行突變生物合成研究的新進展。

【關鍵詞】 微生物藥物

Review on mutational biosynthesis in microbial medicinal fields

ABSTRACT Mutational biosynthesis since its rising in1970′s，as a tool for the formation of antibiotic structural analogues，has played an important role and developed some novel derivatives which are still widely used in the clinic today.With the advance of gene engineering，mutants can be obtained by direct gene modifi-cation to certain enzyme in secondary metabolism pathway and efficiency is greatly promoted.In this paper，the progress，especially combining gene engineering of mutational biosynthesis is reviewed.

KEY WORDS Mutational biosynthesis（MBS）; Mutasynthon; Blocked mutant; Antibiotics

新疾病的產生和耐藥菌的出現，迫切呼喚新的生物活性物質的開發。人們主要從三個途徑獲得新的活性物質:①自然界;②化學合成以及化學改造;③對產生菌的次級代謝途徑進行改造，使其合成途徑發生改變，以獲得新化合物，主要包括突變生物合成（muta-tional biosynthesis，MBS）和前體定向生物合成（pre-cursor directed biosynthesis，PDB）。盡管前兩種方式在新藥開發過程中仍然占主導地位，但后者特別是MBS也為一種十分有效的途徑，且顯示出巨大的潛力。

MBS是指抗生素產生菌經過物理、化學等誘變因素的作用或通過基因改造，生物合成途徑中的某一位點發生突變，喪失合成完整抗生素分子的能力而成為阻斷突變株。在發酵培養這種阻斷突變株時，添加某種天然的或化學合成的化合物——突變合成元（muta- synthon）參與生物合成并獲得新抗生素的方法和過程。廣義的MBS還包括利用生物合成途徑改變獲得原抗生素的代謝產物和利用阻斷突變株積累一些原始菌株所不能積累的抗生素中間體。

1969年，Shier用MBS方法對新霉素進行結構改造。1975年，Nagaoka等用“idiotroph”——獨需型（特需型）來描繪那些需要加入外源前體完成新衍生物合成的突變株，并用“mutational biosynthesis”——突變生物合成來描繪這種技術。1977年Rinehart將這種技術定義為“mutasysthesis”。按照Rinehart的解釋，利用MBS技術制備新衍生物應包括:①突變株的獲得;②突變合成元的獲得;③添加的突變合成元被細胞吸收并參與新衍生物合成。此外，后續工作還應包括新衍生物的分離和結構鑒定，以及生物活性評價。

本文按結構類別介紹MBS技術在微生物藥物領域的研究應用，特別是近年來結合基因技術進行MBS研究的新進展。

1 突變生物合成在氨基糖苷類抗生素中的應用1～5］

氨基糖苷類抗生素是臨床上重要的抗感染藥物，但存在一定程度的腎、耳毒性。因此，對已有品種進行改造，開發對耐藥菌有效、腎（耳）毒性相對較小的新品種一直是新藥研究人員追尋的目標。20世紀70年代，人們利用MBS技術對氨基糖苷類抗生素進行改造，獲得成功，特別是涉及2-脫氧鏈霉胺（2-deoxystrepta-mine，DOS）獨需型阻斷突變株的研究。如Rosi等通過誘變獲得慶大霉素產生菌絳紅色小單孢菌（Micromo-nospora purpurea）D-突變株后，添加鏈霉胺，生成2-羥基-慶大霉素，該化合物對含有2”-腺苷腺化酶的慶大霉素耐藥菌有較強活性，毒性低，在臨床上被廣泛使用。這方面的研究Rinehart等曾進行過總結，本文不做詳細敘述。

值得提出的是，20世紀80年代趙敏等通過誘變獲得a位點（Fig.1）阻斷的突變株JIM-401，該突變株代謝產物中慶大霉素C 2b （GM C2b ）組分即小諾米星的產量大大提高，并實現工業化生產;再以JIM-401為出發菌株，獲得c位點阻斷的突變株JIM-202，該突變株的代謝產物中慶大霉素C1a （GM C 1a ）的積累量大大增加（含量在85%以上），在其2-脫氧鏈霉胺1-N位引入一個乙基，經半合成獲得新化合物1-N-乙基慶大霉素C1a （etimicin，依替米星）;再以JIM-202為出發菌 株，獲得b位點阻斷的突變株JIM121，其代謝產物中 西索米星（sisomicin）組分的產量大大增加。

目前，丁酰苷菌素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素、鏈霉素等氨基糖苷類抗生素的生物合成基因簇的研究取得了可喜的成就，這為利用MBS方法結合現代基因技術對氨基糖苷類抗生素進行改造提供了有利條件。

2 核苷類抗生素的MBS研究［6，7］

Nikkomycin是唐德鏈霉菌（Streptomyces tendae）Tü901產生的一種核苷肽類抗生素，與幾丁質合成酶底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺有類似結構，競爭性抑制幾丁質合成酶，干擾真菌細胞壁的合成，是一種低毒的抗真菌及殺蟲劑。

尿嘧啶和4-甲酰基-4-咪唑啉-2-酮是nikkomycin生物合成途徑中的兩個中間體，分別對應Z和X組分。1984年，Delzer等通過誘變獲得pyr - 突變株。該突變株不能合成以尿嘧啶為中間體的nikkomycin。添加23種N-雜環化合物進行MBS研究，其中胸腺嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶和5-氟尿嘧啶可被利用合成新的衍生物。

1999年，Bormann等采用基因工程方法進行MBS的研究，構建了L-賴氨酸-2-氨基轉移酶失活突變株S.tendae nikC，該突變株不能合成nikkomycin I，J，X，Z肽基側鏈的前體哌啶-2-羧酸，積累了nikkomycin的核苷成分。當添加吡啶甲酸時，可恢復產生nikkomycin I，J，X，Z;添加苯甲酸，獲得Bx和Bz組分（如Fig.2所示）。Bx和Bz比X，Z有較高的pH穩定性，Bx對白念珠菌有更高的抑菌活性。

此外，Bormann等還構建了產nikkomycin LX 和L 的突變株，獲得的新衍生物也顯示出很好的抗菌活性。目前，nikkomycin產生菌分子生物學特性的研究已經取得了巨大的成就，通過MBS技術并結合基因手段，相信會有更多更優質的產品出現。

3 Clorobiocin的MBS研究［8，9］

Clorobiocin、新生霉素（novobiocin）和coumer-mycin（香豆霉素）是由鏈霉菌產生的一類具有抑制 DNA旋轉酶活性的抗生素，同屬于氨基香豆素家族，

Fig.2 MBS of nikkomycin 能夠與細菌DNA旋轉酶B亞基緊密結合，有效抑制該酶活性，實現抗菌作用。對氨基香豆素類抗生素的研究主要集中在clorobiocin和新生霉素，兩者的結構如Fig.3所示，包括三個部分:ring A，3-異戊烯基-4-羥基-苯甲酰（3-prenyl-4-hydroxybenzoyl，DMAHB）;ring B，3-氨基-4，7-二羥基香豆素（3-amino-4，7-dihy-droxycoumarin，ADHC）;ring C，諾維糖（L-noviose）。2004年Galm等通過基因手段構建了clorobiocin產生菌異戊烯基轉移酶失活突變株——cloQ - 。該突變株不能合成DMAHB前體。添加DMAHB類似物（如Fig.4所示）獲得了28種clorobiocin衍生物。體外活性研究發現，新衍生物對大腸埃希菌DNA旋轉酶抑制活性是新生霉素的50%～200%，但即使是活性最高的衍生物，其活性僅為clorobiocin的50%;對枯草芽孢桿菌ATCC14893的生長抑制活性比新生霉素和clorobiocin都低;大部分新衍生物對葡萄球菌均有效。

4 糖肽類抗生素的MBS研究

活性與萬古霉素相當，但對厭氧菌尤其是梭狀芽孢桿菌的抑制活性要高得多。因此，balhimycin具有很好的臨床價值。

目前，對balhimycin等糖肽類抗生素的結構改造研究主要集中在非蛋白組成氨基酸，如β-羥基酪氨酸（Hty）、3，5-二羥基苯基甘氨酸（Dpg）和4-羥基苯基甘氨酸（Hpg）等。

2002年，Pek等第一次用MBS技術對balhimycin進行研究（Fig.6a），刪除過氧化氫酶基因bhp的一段序列，獲得Hty合成阻斷突變株。添加Hty，修復bal-himycin生產能力;添加外消旋3-氟-β-羥基酪氨酸合成了fluorobalhimycin;添加2-氟，3，5-二氟-β-羥基酪氨酸也合成了相應的fluorobalhimycins;D/L-酪氨酸以及酪氨酸酚羥基被氟取代或位置改變的類似物，未能摻入到新衍生物的合成，說明酚羥基的重要性。活性研究表明，所有的氟化balhimycin衍生物對枯草芽孢桿菌都有抑制活性。

2004年，Weist等刪除Dpg編碼基因dpgA的一段序列，獲得Dpg合成阻斷突變株。添加Dpg，修復balhimycin生產能力;添加4種單、雙取代羥基、甲氧基的Dpg類似物（Fig.6b）均獲得了新衍生物;通過添加實驗，Weist等共獲得20多種糖基化方式不同的衍生物。有趣的是，添加3-單取代-苯基甘氨酸，合成的新衍生物有一部分在7位Dpg和5位Hpg間缺少正常balhimycin的AB-環聯芳鍵。 CDA CDA（calcium-dependent antibiotic）是由天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）A3產生的酸性脂肽類抗生素，其結構與達托霉素（daptomycin）類似，分子中有許多D-氨基酸和非蛋白組成氨基酸，與免疫抑制劑環孢菌素、抗腫瘤藥物博來霉素和抗菌藥物萬古霉素同屬于非核糖體合成肽（nonribosomal peptides）家族。CDA的結構如Fig.7所示，根據R 6 、R 9 、R10 和R 11 上取代基的不同，分為CD A 1b 、CD A 2b 、CD A 3b 、CD A4b 、CD A 2a 、CD A 4a 等組分。英國曼徹斯特理工 大學（UMIST）和Sanger研究所對CDA基因簇結構研究結果顯示，82Kb的基因簇序列包含了至少40個開放閱讀框（SCO3210-SCO3249），并利用分子手段結合現代分離檢測技術對各閱讀框的功能和CDA的生物合成途徑進行了研究和推理。

2002年，Hojati等利用分子生物學手段獲得4-羥基-苯乙醇酸合成酶基因hmaS（SCO3229）被破壞的突變株，該突變株不能合成CDA分子重要的結構單元4-羥基-苯基甘氨酸（Hpg）。添加外消旋4-羥基-苯乙醇酸或4-羥基-苯乙醛酸或L-Hpg可恢復CDA的生產能力;添加苯乙醇酸、苯乙醛酸、苯酰甘氨酸類似物（脫羥基或羥基被鹵元素取代），獲得了芳香側鏈4位羥基被H取代的衍生物CDA 2d 和被F取代的 R6 R 9 R10 R11 CAD1b OH OPO3 H2 H H-H CAD 2a OH OPO3 H2 CH 3 π-bond CAD2b OH OPO 3 H2 CH3 H-H CAD3a OH OH H π-bond CAD3b OH OH H H-H CAD 4a OH OH CH 3 π-bond CAD4b OH OH CH3 H-H CAD2d H OPO3 H2 CH3 H-H CAD1ta F OPO 3 H 2 CH 3 π-bond CDA 2td F OPO3 H 2 CH3 H-H Fig.7 Structure of CDA analoguesCDA 2fd ;而添加4-氯苯乙醛酸以及含對氯和對甲氧基的類似物，均未得到類似CDA2fd 的衍生物。

5 聚酮類抗生素的MBS研究

5.1 Rapamycin（雷帕霉素）［20～23］

Rapamycin是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygro-scopicus）NRRL5491產生的31元大環內酯類免疫抑制劑，結構與FK506（tacrolimus，他克莫司）和immunomycin相似（Fig.8）。臨床上主要用于自身免疫病和組織器官移植時產生的排異反應的治療。

來源于L-賴氨酸的六氫吡啶酸是rapamycin聚酮環的重要組成結構。研究表明，rapL基因編碼的RapL（賴氨酸環化脫氨酶）催化L-賴氨酸生成L-六氫吡啶羧酸。

1998年，Khaw等通過ΦC31噬菌體介導的基因置換使rapL產生移碼突變，構建了RapL失活突變株LEK111。當用TSBGM完全培養基發酵培養野生型菌時，產生rapamycin和prolylrapamycin（脯氨酰雷帕霉素，L-脯氨酸取代L-六氫吡啶羧酸），兩者比例約為20∶1;同樣條件下發酵LEK111，則產生少量rapamy-cin和prolylrapamycin，且prolylrapamycin的相對含量大大增加;添加L-六氫吡啶羧酸，產生rapamycin的量和野生型菌株幾乎相當;添加L-反-4-羥脯氨酸，產生兩種新的rapamycin類似物［4-羥脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin（4-hydroxyprolyl-26-demethoxy-ra-

pamycin）和4-羥脯氨酰rapamycin（4-hydroxyprolyl- rapamycin）］;L-順-4-羥脯氨酸、L-順-3-羥脯氨酸也可以摻入到rapamycin中，但新物質結構未闡明;3，4-雙羥脯氨酸和吡啶羧酸未能摻入到rapamycin中。體外活性順序為rapamycin>脯氨酰rapamycin>4-羥脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin。

2001年，Chung等通過同源雙雜交技術，獲得一個rapamycin基因簇rapQONML被破壞的突變株，在添加六氫吡啶羧酸后，生成16-氧-去甲基-27-去甲氧基rapamycin，而非rapamycin。

2003年，Graziani等添加RapL的抑制物到野生型菌的發酵液中，進行類似MBS的研究，在添加噻嗪烷羧酸后，生成了含硫的rapamycin類似物。

Gregory等也曾采用基因手段對rapamycin產生菌進行MBS研究［23］ 。

5.2 Enterocin（伏爾加霉素，恩特洛霉素）［24］ Enterocin和wailupemycin是由Streptomyces maritimus產生的結構相似的抑菌劑，其生物合成途徑如Fig.9所示。由encP基因編碼的苯丙氨酸氨基裂合酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）對entero-cin和wailupemycin的起始前體苯甲酰CoA的合成起著決定性作用。

2003年，Kalaitzis等通過同源雙雜交技術，刪除了442bp的EncP序列，構建了PAL失活的S.mari-timus突變株XP。添加芳香酸（包括單取代苯甲酸、雜環芳香酸、1-烯-環己烷甲酸），發現單取代苯甲酸中，只有對-氟苯甲酸可被利用，生成20-氟代enterocin、5-脫氧-20-氟代enterocin和19-氟代wailupemycin D～G;2-噻吩甲酸和3-噻吩甲酸以近似1∶2的比例摻入到enterocin和wailupemycin類似物分子中，但雜環化合物如呋喃酸（糖酸）、煙酸未能摻入;添加1-烯-環己烷甲酸，只生成了enterocin類似物;添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）基礎上改造而來的芳香酰CoA硫酯的模擬物，只有苯甲酰-SNAC和2-噻吩甲酰-SNAC以很低的效率摻入到enterocin和wailupemycin G的分子中，而對-甲苯酰-SNAC和對-氯-苯甲酰-SNAC未被利用。這是Kalaitzis等第一次利用MBS技術對PKSⅡ型的大環內酯抗生素進行結構改造的研究。上述實驗數據說明Ⅱ型PKSs對外源起始單元的耐受性相對較低，具體的機制還有待進一步的研究。

5.3 Erythromycin（紅霉素）［25］

紅霉素是1952年從紅霉素鏈霉菌（Streptomyceserythreus）培養液中分離出來的堿性大環內酯類抗生 素，有A、B、C、D、E等組分。紅霉素分子包括三部分:紅霉素內酯（erythronolide）、去氧氨基己糖（desosa-mine）和紅霉糖（cladinose）。

6-dEB（6-脫氧紅霉素內酯）是紅霉素合成途徑中最早的中間體，在羥化酶的作用下，C-6位羥基化形成紅霉素內酯參與生物合成。早期曾獲得不能合成6-dEB的突變株2NU153，添加一系列的紅霉素內酯類似物，合成了許多新的衍生物2］ 。6-dEB是在聚酮合成酶（polyketide synthases）DEBS催化作用下，由丙酰-CoA和六個甲基丙二酰-CoA以類似脂肪酸合成的途徑生成的。DEBS包括三個亞基:DEBS1、DEBS2和DEBS3，每個亞基包含兩個模塊，其中DEBS1還包含荷載域（loading domain），DEBS3還包含一個硫酯酶TE;Pieper等研究表明DEBS1的荷載域對底物的特異性有較大的寬容性，除正常的丙酰-CoA外，還可以接受乙酰-CoA、丁酰-CoA和N-乙酰半胱氨酸（SNAC）硫酯等。Khosla等1997年通過分子手段使DEBS1酮基縮合酶失活，并構建質粒p JRJ2 ，通過質粒將6-dEB基因轉移到異源宿主天藍色鏈霉菌（Strep-tomyces coelicolor）中，獲得工程菌CH999。添加SNAC-硫酯類似物，修復6-dEB的生產能力，并形成新衍生物。然后將這些新衍生物添加到Streptomyces erythreus發酵液中，通過生物轉化作用，合成一系列erythromycin D的類似物（Fig.10）。研究發現，SNAC的穩定性和添加時間直接影響到MBS的成功與否及新衍生物的產量。

目前，對紅霉素生物合成途徑和基因簇的研究已經比較透徹，為合成新的衍生物提供了重要基礎和有利條件。

5.4 Avermectin［26～32］ Avermectins（AVM）是由除蟲鏈霉菌（Strepto-mycin avermitilis）產生的具有殺昆蟲、殺螨、殺線蟲活性的16元大環內酯類抗生素，結構如Fig.11所示。AVM分子主要由兩部分（十六元大環內酯環和L-齊墩果糖二糖）組成，根據C5、C22-23、C26位結構的不八個組分。AVM的起始單元來自L-Ile和L-Val，它們在支鏈氨基酸轉氨酶的作用下生成α-酮酸，然后在支鏈氨基酸α-酮酸脫氫酶BCDH的作用下分別生成2-甲基-丁酰-CoA和異丁酰-CoA。在此基礎上，進一步合成AVM a和b。早在1986年Bu′Lock等就通過誘變獲得BCDH失活的突變株，利用MBS技術對AVM C25位上的結構進行改造。1991年，Hafne等詳細介紹了采用NTG誘變獲得BCDH失活突變株的過程，并獲得性能穩定的突變株ATCC53568。之后，Dutton和Bu′Lock等利用ATCC53568進行了系統的MBS研究，添加800多種突變生物合成元，獲得了36種新衍生物，均表現出很好的生物活性。其中，最重要的一個衍生物就是多拉克汀（doramectin），它被認為是采用MBS技術合成的AVM家族中最優秀的成員。多拉克汀是在發酵培養BCDH失活突變株的過程中添加環己烷羧酸（cyclohexanecarboxylic acid，CHC）獲得的。因為BCDH失活，不能利用L-Ile和L-Val為起始單元合成正常的AVM，CHC在脂酰-CoA合成酶的作用下，參與到新起始單元的合成。其結構如Fig.11所示，環己烷取代C25位上的原有結構。多拉克汀抗蟲譜廣、活性強，為極具開發潛力的抗蟲新藥。

1995年，Skinner等分別對BCDH的兩個基因（bkdABC和bkdFGH）進行研究，發現F基因中斷，添加2-甲基丁酸，只產生a組分。添加環己烷羧酸合成多拉克汀。

2000年，Croop等從S.collinus中克隆到一個能夠合成環己烷甲酸-CoA的基因，并成功地將該基因導入Streptomycin avermitilis bkd突變株中，使合成的環己烷脂肪酸占總脂肪酸的49%。這樣，在不添加環己烷甲酸的情況下也能產生多拉克汀。隨后，Stutz- man-Engwall等通過插入失活、定點突變和錯配PCR 等技術使aveC失活，獲得CHC-B1 （多拉克汀）與CHC-B2 的比例增大4倍的突變株。經過上述改造獲得的工程菌，其多拉克汀的產量大大提高，并應用于工業生產。

6 Siderophore的MBS研究［33］

Siderophore是微生物產生的一類低分子量的Fe離子螯合劑，具有很強的Fe離子親和力，滿足微生物對鐵元素的需要。Phenolic是siderophore家族重要的成員之一，是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugi-nosa）產生的酚代side-rophore。水楊酸（salicylic acid）是phenolic生物合成的關鍵中間體。

1991年，Ankenbauer等構建了水楊酸合成阻斷突變體Sal-IA602。Ankenbauer等添加13種水楊酸類似物到IA602的發酵液中，發現其中只有5-氟水楊酸（5-fluorosalicylic acid）、4-甲基水楊酸（4-methylsali-cylic acid）和3-羥基吡啶甲酸（3-hydroxypicolinic acid）可摻入到pyochelin類似物的生物合成中，并相應的生成5-氟pyochelin、4-甲基pyochelin和6-aza-pyochelin（Fig.12）。活性研究表明，三者都具有Fe離子運輸活性，活性順序為4-甲基pyochelin>Phenolic>6-azapyochelin>5-fluoro-pyochelin。

7 討論

突變生物合成是在研究抗生素次級代謝途徑的過程中興起、發展和完善起來的。最初在氨基糖苷類抗生素中得到廣泛應用。到目前為止，幾乎涉及到抗生素的各個類別，特別是氨基糖苷類、聚酮類和多肽類，開發了許多優秀品種，如2-羥基慶大霉素、N-乙酰西索米星、多拉克汀和依替米星等。同時，也在非抗生素領域得到應用，如對siderophore和rapamycin衍生物的研究。

MBS的發展很大程度上決定于突變株的檢出，在分子生物學技術應用于MBS以前，主要靠化學、物理誘變來獲得突變株，這種方法具有很大的隨機性，而且工作量大，限制了其發展。基因技術的發展使突變株的獲得方式發生了巨大變化:直接改造藥物的生物合成基因，有目的性和針對性地獲得突變株。新階段MBS研究的發展還得益于以下幾個方面:①微生物次級代謝途徑和基因簇研究的深入;②現代分離檢測方法特別是HPLC-MS的應用;③突變合成元來源的擴大;④酶工程的發展。

作為產生微生物藥物衍生物的重要手段，MBS有著巨大的發展潛力，主要體現在:①與半合成相比，污染少、成本低，而且有些衍生物不能通過化學方法制備;②新衍生物的發酵工藝、提取工藝、所需設備等與原品種相似或相近，甚至稍做改動便可實現工業化生產，具有很好的經濟效益和社會效益;③微生物次級代謝途徑和基因簇研究的深入，為MBS提供了更多的研究對象。

MBS技術更廣泛地應用存在一些限制因素如:①盡管利用基因技術可以有目的的獲得所需要的突變株，但由于酶的專一性，使得突變合成元的選擇范圍受到很大限制;②摻入量有限，給新衍生物的檢測、分離和工業化增加了難度。針對這些問題，需要對產生菌進一步改造、對發酵條件進行優化、對提取分離檢測方法進行改進。

MBS本身也存在一定的局限性，即MBS主要是對微生物藥物的母體結構進行改造，為藥物結構類似物的研究制備方法。

盡管MBS技術還存在這樣那樣的問題，許多優秀的衍生物品種，特別是多拉克汀的開發成功，無疑預示著其巨大的潛力。