作者：李劍勇，楊亞軍，張繼瑜，才學鵬

【摘要】 應用現代科學技術研究中藥有效成分，是中藥現代化研究的重要內容。利用分子烙印高分子制成親和色譜柱，利用色譜分離技術的高速高效性和質譜測定技術的高靈敏度和獨有的混合解析能力，在線連接HPLC-MS，可以直接從中藥復雜體系中分離、篩選出有效成分并進行直接鑒定，實現中藥有效成分的分離、篩選、鑒定一體化技術。文章簡要從分子烙印聚合物及其制備、模板分子、功能性單體及聚合條件的選擇、技術特點、應用狀況及前景等方面簡單介紹中草藥有效成分篩選鑒定一體化技術中最有應用前途的分子烙印高分子技術。

【關鍵詞】 中藥有效成分； 分離篩選鑒定一體化技術； 分子烙印技術

Abstract：It is an important aspect of modernization for Chinese traditional herb that active composition of Chinese traditional herb is studied with modern science and technology.Affinity chromatography is prepared through molecularly imprinted polymers (MIPs) . Based on high performance of chromatographic separation technology and highly sensitive and special combinational analysis ability of mass spectrogram， MIP-HPLC-MS is connected. Therefore， active composition from Chinese traditional herb may be separated， selected and identified， which realized combinational technology of separation， selection and identification for active composition of Chinese traditional herb. The mechanism of molecular imprinting technology (MIT) and synthetic processes of MIPs were introduced in this paper. Application of MIT for separation， selection and identification for active composition of Chinese traditional herb were summarized， and the trends of MIT were also discussed in this paper.

Key words： Active composition of Chinese tradational herb； Combinational technology of separation，selection and identification； Molecular imprinting technology 隨著科學技術的快速發展，現代藥物的創制經歷了由快速、低成本向研發周期延長、高成本的模式發展。為了加速新藥研制的速度，歐美制藥公司不斷地采用及開發先進技術。例如，采用組合化學方法快速生產建立包含成千上萬化合物的庫；采用各種快速高效的篩選檢測方法去發現藥物前體；將藥物新陳代謝機理和毒性的研究提前到藥物發現這一環節來進行等。中藥是我國的優秀特色醫藥遺產，其種類繁多，歷史悠久，實踐證明對許多疾病療效確實。因此，從中草藥中創制新型藥物是切實可行又簡捷的方法。 應用現代科學技術研究中藥有效成分，是中藥現代化研究的重要內容。經過幾十年的努力，已經取得了許多重要成果，發現了大量活性化合物，有些已經開發成新型的藥物。事實證明，中藥有效成分是中藥發揮治療作用的物質基礎。但到目前為止，僅有一百多種常用中藥的主要成分經過了比較詳細的研究，大量中藥及其成分仍有待研究。研究中藥含有的有效成分，特別是對大量的中藥進行活性成分的研究，應用高通量藥物篩選的方法具有明顯的優勢，可以提高研究速度和效率。高通量藥物篩選需要大量的樣品，也可以借助新的樣品制備方法和設備，提取不同的樣品，包括單一化合物、提取組分或部位。同時積累各種中藥樣品，建立樣品庫，供不同的篩選模型使用，提高樣品的利用率。對中藥單一化合物成分的活性篩選，可以根據獲得的結果直接評價化合物的生物活性和藥理作用。但對于含有多種成分的提取物或部位，則可以根據活性結果進行跟蹤提取分離，最終發現活性化合物或確定活性組分［1］。 將化合物分離鑒定手段與高通量藥物篩選技術相結合，可以直接對提取的組分進行分離和活性檢測并鑒定，不僅可以節省研究費用，提高發現活性化合物的速度，同時也可以保證研究目標的準確性。 基于分子識別原理，根據靶酶、分子烙印高分子及藥物抗體與活性成分結合能力的差異，分別利用靶酶、分子烙印高分子及藥物抗體制成親和色譜柱，利用色譜分離技術的高速高效性和質譜測定技術的高靈敏度和獨有的混合解析能力，在線連接HPLC-MS，可以直接從中藥復雜體系中分離、篩選出有效成分并進行直接鑒定，實現中藥有效成分的分離、篩選、鑒定一體化技術，其過程如圖1所示。這是最近幾年出現的藥物篩選新技術之一［2］。如利用細胞膜色譜法篩選鑒定了當歸、太白花、紅毛七中的有效成分［3～5］；利用抗體親和色譜柱篩選出抗丙型肝炎的先導化合物；利用分子烙印聚合物親和色譜柱成功篩選出抗腫瘤的EGFR抑制劑，實驗證明活性化合物在這幾種柱中的保留時間與活性成正比［6］。

圖1 中藥有效成分的分離、篩選、鑒定一體化技術（略） 由于MIPs具有較高的預定選擇性，獨特的化學、物理穩定性，分子識別能力不受酸、堿、熱、有機溶劑等環境因素影響的優點，以及制備簡單、可重復使用等特點，在分離、分析中展示了美好的應用前景。下面從分子烙印聚合物及其制備、模板分子、功能性單體及聚合條件的選擇、技術特點、應用狀況及前景等方面簡單介紹中草藥有效成分篩選鑒定一體化技術中最有應用前途的分子烙印高分子技術。

1 分子烙印聚合物及其制備 分子烙印技術，也稱分子印跡技術（MIT），其應用前提是能夠制備出具有分子識別能力的聚合物材料-分子烙印聚合物(MIPs)。MIPs的制備過程大致為：①將模板分子和功能單體按照一定比例混合后在一定條件下反應，通過共價鍵或非共價鍵作用形成可逆的模板分子-功能單體復合物；②加入交聯劑等，使之與前面的模板-功能單體復合物通過聚合反應形成多孔性的高聚物；③將模板分子從高聚物中抽提出來，這樣在聚合物的骨架上便留下了一個對模板分子有“預定”選擇性的分子識別位。分子烙印聚合物中的空腔和模板分子形狀、大小完全一樣，從而實現對模板分子的特異性識別。其過程見圖2 ［7］。 根據模板分子和功能單體形成復合物時作用力的性質，MIPs分為共價型和非共價型兩種。共價型MIPs制備過程中，模板分子和功能單體通過可逆的共價作用，如形成可逆的硼酸酯和席夫堿。而在非共價型MIPs生成過程中，模板分子和單體則可通過氫鍵、偶極、離子、金屬螯合、電荷轉移、π-π共軛作用、疏水乃至范德華力等相互作用形成復合物。

圖2 分子烙印材料的制備過程示意圖（略） 當這些微弱的相互作用在溶液中建立起來后，參與自組裝的分子自發地安置在液相溶劑中，聚合作用被引發，這些分子因高度的交聯聚合作用而在空間上被固定，然后將模板分子抽提移走，中間形成一個空穴。用這種方法合成的MIPs檢驗模板分子和/或類似物時，其擴散進入分子烙印聚合物的互補位置，它們之間又能重新成鍵。 共價型MIPs中，單體-模板所形成的配合物十分穩定，且相互間存在著當量關系。因此分子烙印過程（即高聚物內客體鍵合點的結構等）明確而清晰；由于共價連接的穩定性，因此可在較寬的聚合條件下，如在高溫，高或低的pH，或高極性溶劑中進行聚合。但是，單體-模板配合物的合成較困難，同時也不經濟；可以采用的可逆共價聯接體系數目有限；在某些情況下，會因第3步劇烈的工作條件（使共價鍵聯接斷裂）而使烙印效果變差；客體的結合和釋放都較慢，這是因為它們都涉及鍵的形成和斷裂過程。 非共價鍵型MIPs中，不必合成共價的單體-模板配合物；因為其之間僅有較弱的非共價相互作用力，可在溫和的條件下將模板從聚合物中除去，同時客體的鍵合和釋出都有很快的速度。但是，烙印過程的輪廓不夠清晰，因為單體-模板加成物易于變化，而無嚴格的計量關系；聚合過程的條件必須仔細加以選擇，使混合物中非共價的加合物能最大程度的穩定存在；由于在大量功能單體存在的條件下（為使平衡有利于加合物生成）常會出現非特征的鍵合點，于是體系結合底物的選擇能力降低。對非共價鍵克侖特羅MIPs的液相色譜特性的研究表明，在磷酸鹽緩沖液/乙腈洗提條件下，其可以識別出其他所有腎上腺素結構樣物質［8］。目前絕大多數MIPs均是通過非共價型MIT制得的。 除了以上兩種基本模式以外，還有一種將這兩種模式綜合在一起的技術，即聚合時功能性單體與模板分子間的作用力是共價鍵，而在對烙印分子的識別過程中，二者之間的作用力是非共價鍵。Whitecombe等［9］將膽固醇與功能性單體4-乙烯基苯基碳酸酯共價結合后，用堿水解時隨著CO2的釋去而打開了單體和烙印分子間的共價鍵，此時MIP上便產生了一個非共價型的分子識別位，在分子識別中通過氫鍵結合膽固醇。用這種方法已經制備了體積較大底物（如藥物分子、類固醇、糖類等）的分子烙印聚合物，這些聚合物具有多位結合的結構。

2 模板分子、功能性單體及聚合條件的選擇 MIPs形成中經過的兩大步驟是兩個相反的過程，它要求模板分子既能參加聚合反應，又能提取出來。作為模板的分子都應含有形成弱相互作用力或可逆共價鍵的基團，能滿足要求的化合物主要有糖類（包括甘露糖、半乳糖、果糖）、氨基酸及其衍生物；蛋白質、核苷酸及其衍生物；嘌呤、嘧啶等生物堿；羧酸、二醛、膽固醇、維生素、酶、神經遞質如乙酰膽堿；殺蟲劑、除草劑、染料、藥物以及重金屬等。 功能單體的選擇主要由模板分子決定，首先必須能與模板分子成鍵，且在反應中它與交聯劑分子處于合適的位置，能使模板分子恰好鑲嵌其中。常用的功能性聚合單體有甲基丙烯酸（MAA）、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物、丙烯酰胺等等。一般認為MAA與氨基之間可發生質子化作用，同酰基、羧基、氨基甲酸酯之間可產生氫鍵作用。為得到穩定的模板-單體復合物，所選擇的功能單體應與模板間存在盡可能強的分子間作用力（如氫鍵、離子對作用等），因此對含有堿性官能團（如氨基等）的模板應選擇含羧基的功能單體（MAA等）；而含酸性功能基團（如羧基、酚羥基）的模板應盡可能用堿性功能單體如乙烯基吡啶。有時根據模板分子的結構，采用與模板分子具有多作用位點的功能單體，可使聚合物的選擇性大大提高。此外，對某些模板分子采用混合功能單體，亦能提高分子烙印聚合物的選擇性。Jorge Luis［10］在研究氯霉素分子烙印時采用混合功能單體，二乙氨基乙基丙烯酸甲酯（DAM）與2-乙烯基吡啶摩爾比是25 : 75，混合功能單體與氯霉素的摩爾比為2 : 1，在50 ℃條件下，制備的氯霉素分子烙印聚合物，實驗結果表明混合功能單體聚合物的烙印效果優于單一功能單體；Wang等［11］在研究氨基酸衍生物分子烙印時，2-乙烯吡啶和丙烯酰胺的混合物為功能單體，也得到了類似的結果。 交聯劑最常見的主要是乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、季戊四醇三丙烯酸酯以及一些乙烯基衍生物，如二乙烯基苯等。 分子烙印過程主要通過自由基引發，其引發方式主要有高溫熱引發和低溫光引發。具體的聚合條件選擇則視具體情況而定，因為影響反應的因素很多，如濃度、溫度、光照及溶劑的種類和極性等。常用的引發劑有偶氮二異丁腈（AIBN）、偶氮二異庚腈（ADVN）等。 由于非共價作用的強弱強烈地依賴于溶液的極性，所以非共價方式一般選擇在有機溶液如氯仿、甲苯中進行，而共價方式一般選擇在極性較強的水、醇等溶液中進行。

3 分子烙印技術(MIT)的特點

3.1 選擇性高MIP依靠分子形狀、大小及官能團進行分子識別，類似于生物體系中酶對底物、抗體對抗原或受體對抑制劑的作用，因此，其對模板化合物及其類似物（包括空間結構相似的化合物）具有較高的選擇性，在某些體系中，MIP的識別已優于傳統方法制備的抗體，從而MIP又被稱為模擬抗體。目前，MIP作為分子識別材料，除了被用于手性分離、免疫分析、傳感器、模擬酶催化以外，在固相萃取(SPE)方面的應用也越來越引起人們的注意。

3.2 穩定性好與生物大分子（酶或抗體）相比，MIP具有制備簡單、周期短、性質比較穩定（耐酸、堿，耐高溫、高壓等）、可在普通條件下存放、能重復多次使用的優點。

3.3 藥物篩選模型的替代性對有些疾病尚無篩選模型或所建立的藥物篩選模型繁瑣危險性較高，可以以對該疾病防治確實的已知藥物為模板，研制MIP與高效液相和色譜聯用技術作為高通量預篩模型的最佳替代，前景廣闊。

3.4 應用范圍廣利用MIPs的選擇性，用其作為吸附劑可以實現對目標化合物的提取、純化和濃縮，使之達到能夠被直接檢出的濃度，從而降低檢測限，提高分析的準確性和精密度，克服樣品體系復雜、預處理繁瑣等不利因素，為痕量組分的富集和分析提供極大的方便。隨著研究的深入，MIT與色譜、毛細管電泳、熒光、電分析法等分析、分離手段結合，利用MIPs的選擇性以及多孔性，在藥物分析、有害成份檢定、環境監測以及催化方面得到廣泛應用。

3.5 藥物研發應用前景大MIP與高效液相和色譜聯用技術可以在中藥研究開發的如下四大領域應用［2］：

3.5.1 尋找先導化合物以一種已知的活性化合物為模板合成相應的分子烙印聚合物，可以將其用于合成的組合化學庫或者天然組合化學庫-中藥體系(包括復方)，直接從構型多樣的庫中提取出來其他結構類似的先導化合物，從而避免了傳統分離提取的非特異性和低效性。

3.5.2 尋找已知藥物替代品高活性的抑制劑在成為藥物之前，必須經過藥理研究、毒性篩選等，許多有效的抑制劑往往因為高毒性或副作用，或者在體內吸收不好而無法最終成藥。而中藥的毒性較小。若以某種高效高毒性的分子作為模板分子烙印出來的聚合物，可以直接從這種天然組合化學庫中篩選出來其他有效并且低毒性的化合物作為替代品；或者某種高效無毒的藥物分子由于合成困難而導致非常昂貴，此時也可以用分子烙印的方法尋找其他成本低廉且容易得到的替代品。

3.5.3 高效提取微量(或痕量)成分在中藥的傳統分離提取過程中，許多有效成分往往因為含量低微而被漏篩或者難以純化出來，利用分子烙印的強特異性和高選擇性可以將一些含量很低的化合物直接從粗提物中提取出來。

3.5.4 制定中藥質量標準中藥在中國的應用已經有幾千年的歷史，但往往由于其成分的復雜性和有效成分不夠明確而難以在國際市場上被認可。如果能夠利用分子烙印的方法對某些有效成分的含量進行監控(可以用色譜或者質譜的手段檢測目標產物的存在及確定其含量)，制定一套質量標準，將有利于中藥的進一步應用推廣。

4 MIT在中草藥有效成分分離鑒定中的應用研究 MIP分離化合物的機制見圖3所示［12］。MIP 應用于動物組織中藥物及其代謝物、中草藥成分提取分離的研究報告較多，也取得了一批有價值的分析方法和材料［13］。如郭文生等［14］采用分子模板聚合物技術對中草藥馬錢子Strychnos nux-vomica L. 粗提物中有效成分馬錢子堿(brucine)、士的寧(strychnine) 進行了選擇性分離。用丙烯酸為單體，TMPTA為交聯劑，合成對馬錢子堿有特異選擇性的模板聚合物(MIP)。選擇性分離出粗提物中的馬錢子堿，純度可達99.7 %，同時得到士的寧為主的生物堿，純度為94.6 %。周力等［15］制備了以槲皮素為模板的分子烙印聚合物（ABC），從沙棘粗提物中分離提取槲皮素和異鼠李素兩種黃酮，得到良好的效果。

a-表示MIP的連接位置對烙印分子有較高的裝載能力；b-表示由于烙印分子對MIP有較高的親和力使得烙印藥物分子緩慢釋放；c-表示烙印對應體（+）被吸附在MIP上，而非烙印對應體（-）由于對MIP連接位置的不相配而釋放；d-表示在連接位置，由于親和力的作用，有較低親和力的藥物被有較高親和力的藥物所取代。

圖3 類似藥物在分子烙印材料上的裝載釋放過程（略） MIP-HPLC-MS應用于中草藥有效成分分離鑒定研究報告較少，但以僅有的報告來看，其前景看好。謝建春等［16］以駱駝蓬種籽中抗腫瘤活性化合物哈爾明及哈馬靈的結構類似物哈爾滿作為模板，用非共價鍵法制備了對哈爾明及哈馬靈具有強親和性的分子烙印聚合物。此分子烙印聚合物作為液相色譜固定相與大氣壓電離飛行時間質譜聯用，直接分離鑒定了草藥駱駝蓬種籽甲醇粗提物中所含的哈爾明及哈馬靈兩種抗腫瘤活性成分。實驗結果證明了通過分子烙印親和色譜與質譜聯用方法，快速有效地對中草藥活性成分分離鑒定是可能的。謝建春等［17］嘗試以丙烯酰胺作為功能單體，以槲皮素為模板，在極性溶劑中，用非共價鍵法制備了MIP。結果表明，MIP對槲皮素具有特異親和性，將該MIP直接分離銀杏葉提取物水溶液，得到主要含模板槲皮素及其結構類似化合物山奈酚兩種黃酮類組分。利用MIP特異親和性從中藥復方中提取、分離具有相同空間結構、相似功能團的有效部位，將會成為中藥復方有效部位提取、分離的有效手段。Vallano等［18，19］利用分子烙印的原理，以抗抑郁癥的去甲替林(NOR)為模板，將去甲替林烙印粒子填充在毛細管HPLC柱上，利用毛細管液相色譜篩選結構類似的抗抑郁癥化合物，結果表明具有和模板大部分結構類似的化合物都能被印跡分子所識別， 尤其是具有環和亞胺的化合物選擇性更好。

5 MIT的發展趨勢 分子烙印高分子技術與分離鑒定的一體化技術，其核心是基于MIPs的快速高效發展。在未來一段時間MIT的研究可能主要集中在如下幾個方面：①分子烙印和識別過程的機理，從熱力學和動力學角度研究增多，從目前的定性和半定量描述向完全定量描述發展，其應用范圍進一步擴大；②合成種類更多、性能更好的功能單體和交聯劑，提高MIPs的吸附行為和吸附容量，如最近雖已提出聚酚、聚氨苯基硼酸酯、過度氧化的聚吡咯、聚氨酯、聚苯二胺、聚苯胺等，但僅能適應相應特殊要求，性能尚待完善；③分子烙印和識別過程從有機相轉向水相，以便接近或達到天然分子即模擬機體內識別系統的水平，從而提高分子烙印聚合物的選擇性和模擬受體的真實性；④在分離技術方面，手性分離和固相萃取手性藥物的MIT步入產業化階段，而商品化的可用于檢測特定化合物的MIPs將不斷出現；⑤烙印技術將從氨基酸、藥物等小分子，過渡到核苷酸、多肽、蛋白質等生物大分子，甚至生物活體細胞；⑥MIP向高效率高特異性發展，如模板與功能單體間的多位點協同作用可提高MIP選擇性，同時最好結合多種作用力。如Cheng等［20］在制備模擬酶時同時采取3種單體(MAA、4-VP和高鐵原卟啉)、3種作用力(氫鍵、靜電和金屬配位作用) ，實現了水相中高的選擇性和催化性能。

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