【摘要】 目的觀察益氣化淤中藥對大鼠胃癌前病變胃黏膜蛋白激酶C（PKC）表達的影響。方法采用MNNG、乙醇、饑飽失常等多因素造模。造模型成功后，將造模存活大鼠隨機分為自然恢復組，中藥高、中、低劑量組， 各組大鼠作相應的處理后， 免疫組化法檢測各組大鼠胃黏膜組織PKC表達水平。結果各治療組PKC表達較自然恢復組下調，有顯著性差異(P<0.05)。結論益氣化瘀中藥可能是下調PKC的表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，而發揮對大鼠胃癌前病變的治療作用。

【關鍵詞】 胃癌前病變 蛋白激酶C 益氣化淤中藥

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Yiqi Huayu Recipe on the expression of protein kinase C(PKC) in rats with gastric precancerous lesions(GPL).MethodsThe model of GPL was established mainly through N-methyl-N-nitro N-nitrosoguanidine (MNNG) together with other factors including alcohol stimulation and undue hunger and overeating. The survived rats after modeling were randomly pided into spontaneous recovery， and high-， moderate-and low-dose of Yiqi Huayu Recipe group. After the corresponding treatment， the expression of PKC was detected by immunohistochemical method. ResultsThe expression of PKC in each treatment group were distinctly lower than that in spontaneous recovery group (P<0.05).ConclusionYiqi Huayu Recipe is effective in the treatment of rats with GPL by inhibiting the expression of PKC.

Key words：Gastric precancerous lesions; Protein kinase C; Yiqi Huayu Recipe 慢性萎縮性胃炎（CAG）伴中重度不典型增生或/和不完全性結腸型化生是胃癌的重要癌前病變。益氣化淤中藥臨床治療胃癌前病變取得了很好的治療效果［1］，為了探討其作用機制，特設計本實驗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

甲硝基亞硝基胍(MNNG)為Fluka公司產品，每周用雙蒸水配成1 g/L的母液4℃避光儲存，臨用時用雙蒸水配成所需濃度；脫氧膽酸鈉購自湖北省醫藥公司；雷尼替丁由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產；PKC小鼠抗大鼠單克隆抗體為SantaGruz 公司產品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶標記鏈親合素(三抗)、DAB、封閉用山羊血清等為博士德試劑公司產品。益氣化淤中藥主要由太子參、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等組成，濃度2 g／ml。

1.2 造模及給藥方法

選用SPF級6周齡SD♂大鼠62只，體質量100～120 g。造模參照嚴茂祥等［2～6］綜合造模方法并加以改進。大鼠自購進后適應性喂養1 d。從62只大鼠中隨機抽取13只作為正常組， 其余49只用于造模。正常組大鼠不做任何處理；造模大鼠每日自由飲用100 mg/L MNNG液(飲料瓶用油漆涂黑避光)、進食含0.3 g/L雷尼替丁的純鼠飼料、上午用56℃ 150 g/L的氯化鈉液按10 ml/kg灌胃，進食2 d，禁食1 d，進食當天下午用8.5 g/L脫氧膽酸鈉溶液按10 ml/kg灌胃。禁食當天下午用400 ml/L乙醇按10 ml/kg灌胃，連續24周。24周末時隨機抽取正常組和造模大鼠各1只，殺檢，觀察組織病理學變化(以HE染色光學顯微鏡下觀察的結果為主)，確認模型是否成功。

造模型成功后，將造模存活的48只大鼠隨機分為自然恢復組12只。中藥高、中、低劑量組(簡稱高、中、低劑量組)各12只。高劑量組每日每只按20 g/kg(相當于成人1 d用量的兩倍)灌胃，中劑量組按10 g/kg(相當于成人1 d用量)灌胃，低劑量組按5 g/kg(相當于成人1 d用量的50%)灌胃。上述治療16周。自然恢復組同正常組大鼠常規飲食。40周末所有動物禁食1 d，處死，剖腹取胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗，肉眼觀察，平鋪于硬紙板上，于胃竇部剪取組織1塊，40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋， 切片5 μm， 免疫組織化學染色。

1.3 PKC蛋白表達PKC一抗稀釋倍數(1∶100)，染色步驟如下:切片脫蠟入水。3%H2O2室溫孵育1 min，以滅活內源性酶。最后蒸餾水洗3次。將切片浸入TAB(0.05 mol/L，pH7.4)中，電爐加熱至100℃，持續30 min。冷卻后進行下一步。滴加抗原修復液，室溫孵育10 min，蒸餾水洗3次。滴加正常5%山羊血清封閉液，室溫孵育10 min，甩去多余液體。滴加稀釋的一抗，4℃濕盒內過夜。TAB洗滌3次，每次5 min，滴加二抗室溫孵育30 min。TAB洗滌3次，5 min/次，滴加三抗(HIGH-SABC)室溫孵育30 min。TAB洗滌3次，5 min/次，DAB顯色。自來水沖洗，蘇木復染，封片。

1.4 觀察方法及判斷標準根據文獻［7］加以改進。切片中出現黃染為陽性。每張切片由兩位觀察者獨立計數，隨機取染色區域4個高倍視野(×400)陽性細胞平均數，用半定量計分。染色強度用0～3級計分：0級為無染色；1級為輕度陽性染色；2級為中度陽性染色；3級為強陽性染色；染色范圍根據細胞陽性染色的百分數而分為0～4級：0級為無染色；1級為5％～10％細胞染色；2級為10％～20％細胞染色；3級為20％～50％細胞染色；4級為>50％細胞染色。染色總評分為染色強度+染色范圍。

1.5 統計學處理方法數據用±s表示， 組間差異性比較采用q檢驗，P<0.05認為有顯著性差異。

2 結果

PKC在正常組中主要存在于胞漿，其他組別中，除了胞漿外，在胞膜和胞核也可見。自然恢復組較對照組PKC表達增強，有非常顯著性差異(P<0.01)；各治療組較對照組PKC表達增強，但沒有顯著性差異(P>0.05)；各治療組較自然恢復組PKC表達下調，有顯著性差異(P<0.05)；各治療組之間比較沒有顯著性差異(P>0.05)。結果見表1。表1 各組大鼠的PKC蛋白表達(略)

3 討論

蛋白激酶C(PKC)是1977年由日本學者Nishizuka等［8］首次在鼠腦的胞質成分中發現的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，其廣泛分布于真核細胞中，由多種具有不同生物學特性的同工酶組成，是細胞內信號傳導的重要遞質。PKC通常處于失活狀態，被激活后可由細胞質轉位到細胞膜，能夠使眾多蛋白質中的絲氨酸和蘇氨酸發生磷酸化而發揮作用。PKC的活化不僅與正常細胞和異常細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學效應有關， 更在腫瘤的發生、發展、轉移和多藥耐藥等方面發揮重要作用。有人采用不同濃度的PKC抑制劑Staurosporine(ST)作用于人胃癌細胞株MGC 803和SGC 7901后，細胞增殖受到明顯抑制，表明PKC在胃癌細胞增殖中具有重要作用［9］。胃癌細胞增殖時，PKC活性表現為上調趨勢，而誘導胃癌細胞凋亡時，它表現為下調趨勢［10～12］，一些化療藥物和抑制增殖及誘導凋亡的藥物如特異性環氧化酶 2抑制劑也通過下調PKC活性而抑制胃癌細胞生長［13，14］。

本實驗結果表明，以MNNG為主的多因素聯合攻擊法誘發的大鼠胃癌前病變(自然恢復組)粘膜PKC蛋白表達明顯增高，胃炎消能使PKC蛋白表達明顯下降(與自然恢復組比較，P<0.05)，我們推測胃炎消可能是通過下調PKC的表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，而發揮對大鼠胃癌前病變的治療作用。

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