作者：黃凱，陳雄生，賈連順，邵將，朱巍，嚴望軍，房雷

【摘要】 [目的]通過MICROS超細粉碎機制備同種異體納米脫鈣骨基質(DBM)，觀察納米DBM結構特征，研究DBM納米化工藝及其作為骨移植替代物的生物相容性。[方法]采用改良Urist法制備同種異體脫鈣骨基質，液氮冷凍球磨機將塊狀DBM預粉碎，使用MICROS超細粉碎機進一步研磨粉碎制備納米DBM。電鏡掃描觀察其結構，按照我國衛生部《生物材料和醫療器材生物學評價的技術要求》中的標準，對納米DBM進行急性毒性實驗、熱原實驗、溶血實驗等檢測。[結果]制備顆粒直徑在50～200納米的脫鈣骨基質，生物相容性檢測無毒性，無熱源性，不引起溶血反應，納米DBM具有良好的生物相容性。[結論]納米DBM可在低溫或控制溫度條件下制備，是一種無毒、無刺激，不含熱源、不引起免疫排斥反應的生物材料，具有良好生物相容性。

【關鍵詞】 納米脫鈣骨基質; MICROS超細粉碎機; 顯微特征; 生物相容性

Abstract: [Objective]To observe the structure characteristics of nano decalcified bone matrix (DBM) produced by MICROS super fine mill， and to study the nano-technologies of DBM and the biocompatibility of nano-DBM as bone graft substitutes. [Methods]Improved Urist method was used to produce DBM. The pieces of DBM was pre-porphyrizated by liquid nitrogen frozen ball mill equipment. The DBM powder were further porphyrizated by MICROS super fine mill to be nano-DBM. The structure of nano-DBM was observed by electron microscope.The experiments on acute toxicity， pyrogen and hemolysis were performed according to theTechnical Evaluation Standards of Biomedical Materials and Medical Instruments promulgated by Chinese Ministry of Health.[Results]The DBM was porphyrizated to the size of 50-200 nm in diameter. No toxicity， pyrogen nor hemolysis of nano-DBM was noted. Nano-DBM exhibited excellent biocompatibility.[Conclusion]Nano-DBM produced under the conditions of low or controlled temperature， is a kind of biomaterial which is avirulent， nonirritant， nonpyrogenic， nonimmunological reaction and reveals good biocompatibility.

Key words：nano-DBM; MICROS; micro-characteristic;biocompatibility

隨著對疾病認識程度的加深及外科技術的發展，臨床上對骨移植的需求量越來越大[1]。據統計，在美國每年約施行42萬余例植骨融合術，其中60%以上為脊柱融合術。用于脊柱融合術的骨移植替代物和促進骨融合相關產品的醫療市場達4～20億美元[2]。按此估算，我國每年實施的脊柱融合術數量不亞于這一數字，其未來的骨移植材料市場需求極大。

目前國內外骨移植的材料主要包括自體骨、異體骨和合成骨替代材料3大類。自體松質骨，特別是自體髂骨被認為是骨移植材料的金標準，但其也存在供骨量及供骨尺寸和大小有限、手術時間延長、患者創傷增加、供骨區并發癥等缺點[3]。同種異體脫鈣骨基質是經過特殊處理制成的一類異體骨，是由膠原蛋白、非膠原蛋白以及較低濃度的生長因子等組成的復合物，是異體骨移植替代材料中免疫源性最弱的一種。不同條件制備的脫鈣骨基質存在骨誘導和骨傳導性能的差異，另外由于脫鈣骨基質失去了絕大部分的無機成分，其生物力學特點幾乎完全消失，不適用于需要承受重力和其他任何應力的部位。

研究、制備理想的骨移植材料替代自體骨用于骨缺損修復是目前醫學和生物材料科學的重要課題。隨著納米科技及納米醫學的飛速發展[4]，納米骨移植材料的相關研究發展態勢迅猛[5]。本文使用MICROS超細粉碎機在室溫環境下將人同種異體脫鈣骨基質粉碎至納米顆粒，并就納米脫鈣骨基質的制備工藝、生物相溶性進行探索，為納米脫鈣骨基質(Nano-DBM)作為一種新的骨移植替代物及骨生長因子載體進一步在臨床推廣應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 MICROS超細粉碎機[6]制備納米DBM

MICROS超微粉碎機是由日本研制的粉碎設備，研磨部件由定子和轉子組成。定子即圓形容器，轉子由主軸與多根副軸相連，每個副軸上都有多個研磨環，每個研磨環均可獨立轉動，各個研磨環之間有微小間隙。

將研磨原料和研磨介質放入容器內，主軸帶動副軸以相同的角速度旋轉，副軸上的研磨環有公轉和自轉。副軸旋轉產生的離心力使研磨環產生徑向位移，與筒壁接觸，夾在研磨環與筒壁間的材料以及夾在2個研磨環之間的材料同時受到擠壓、剪切力的作用而被粉碎。通過調整變壓器可控制主軸的轉速;容器內溫度被實時監測，防止研磨時間長導致材料升溫。

采用手術時切除下來的人體骨，采用改良Urist法[6]制備脫鈣骨基質。將制得的DBM顆粒與鋼質研磨球一同放入液氮冷凍球磨粉碎機的容器內，持續注入液氮條件下以800 RPM研磨2 h。研磨完成后使用網篩將DBM粉末與研磨球分離。

將液氮冷凍粉碎所得DBM粉末置于MICROS粉碎機的容器內，加入適當的蒸餾水，以1 200 r/min的最佳工作轉速進行分時間斷研磨，期間取樣送激光粒度儀進行檢測，研磨完成后取樣送電鏡掃描。

MICROS粉碎機初始研磨溫度為17℃，工作中最高溫度為25℃，研磨時由循環水進行冷卻降溫。粉碎過程中由激光粒度儀測量納米DBM溶液，觀察溶液內顆粒直徑變化趨勢。

研磨結束后將勻漿進行高速離心取得納米DBM，將之塑形后置于37℃恒溫干燥箱內干燥，最終制得納米DBM。樣品經電鏡掃描觀測顆粒直徑及表面結構。

1.2 生物相容性檢測

1.2.1 急性毒性實驗[7] 將鈷60輻照消毒的納米DBM放入無菌生理鹽水中，37℃恒溫水浴箱中持續浸泡120 h制備材料浸提液。

取健康成年小鼠10只，雌雄不限，體重25～30 g，隨機分為實驗組和對照組，實驗組腹腔內注射浸提液(50 ml/ kg體重)，對照組腹腔內注射生理鹽水(50 ml/ kg)。實驗前后均用市售飼料飼養，觀察注射后24、48、72 h小鼠的精神狀態、進食量等指標。

1.2.2 熱原實驗[7] 以上述方法制備DBM浸提液。取新西蘭家兔3只，雌雄不限，體重2. 3～2.7 kg，電子體溫計預測家兔肛溫，1次/ h，共4次，體溫在38. 6℃～39.1℃，且最大溫差≤0. 4℃，參照中國衛生部《生物材料和醫療器材生物學評價技術要求》，符合實驗要求。

7 d后在同樣室溫和濕度下，再次測家兔肛溫2次，間隔1 h，取平均值為正常體溫;自家兔耳沿靜脈推注溫度為37℃的DBM浸提液(10 ml/ kg體重)，注射后每小時測肛溫1次，共3次，以3次中最高的一次減去正常體溫，即為該家兔的體溫升高度數。

1.2.3 溶血實驗[7] 抽取新西蘭家兔靜脈血5 ml，加入2 %草酸鉀0.25 ml，取該兔血4 ml加入0.9 %生理鹽水5 ml進行稀釋，制備出新鮮稀釋兔血。

實驗組：取納米DBM 1份約5 g，浸泡于含有10 ml生理鹽水的試管內，37℃水溫中維持30 min，然后加入0.2 ml稀釋兔血，緩慢混合，在37℃水溫中維持60 min;

陰性對照組：在10 ml生理鹽水中加入0.2 ml稀釋兔血;

陽性對照組：在10 ml蒸餾水中加入0.2 ml稀釋兔血，輕輕振動，使之完全溶血。

陰性和陽性對照均為3只試管，保溫條件與實驗組相同。以2 000 r/min×5 min將所有試管離心，取上清，用分光光度計于波長545 nm測吸光度，每組取3只試管平均值。

溶血程度按以下公式計算：溶血程度= (實驗組吸光度-陰性對照組吸光度)/(陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度)×100%。

2 結果

2.1 納米DBM的檢測結果 MICROS粉碎過程中，激光粒度儀測定溶液樣本顯示：隨著研磨時間的延長，溶液內顆粒直徑有逐漸變小的趨勢，當顆粒直徑達到1微米左右時趨于穩定，延長研磨時間顆粒直徑不再變小(圖1)。

將制備的納米DBM進行電鏡掃描：放大至20 000倍，可見DBM顆粒直徑在50～200 nm左右，分布較均勻，DBM表面具有不規則的納米溝槽[7]。

2.2 生物相容性實驗結果

2.2.1 急性毒性實驗結果 實驗組小鼠，均無死亡，無癱瘓及呼吸抑制等反應，進食、活動、反應等一般情況良好，體重無明顯變化，與對照組相比無明顯差異。納米DBM屬于無毒級。

2.2.2 熱原實驗 各實驗家兔體溫升高在0.15℃～0.35℃，符合熱原檢測規定(表2)，納米DBM無致熱作用。

2.2.3 溶血實驗 根據公式計算，體外新鮮兔血溶血率為3.31%，在允許范圍內(3%～5%)。

3 討論

3.1 DBM納米化工藝的選擇

納米材料的制備方法很多，不同材料選擇的制備方法也不同?？傮w可分為物理方法和化學方法。這些方法在制備納米顆粒時多數需要對材料進行加熱，甚至是高溫高壓處理，適用于金屬、陶瓷等無機物的納米化。DBM等有機材料在高溫高壓下將完全被破壞，即使是加熱或者使用化學試劑的處理都會影響到DBM所攜帶的各種蛋白因子的活性。因此DBM的納米化比較理想的方法是選擇低溫、物理研磨的方法。 圖1DBM粉碎溶液樣本激光粒度儀檢測結果

目前，國內外對有機材料的納米化研究并不多，適用于有機材料納米化的方法、設備也較少[8]。作者選擇的液氮冷凍球磨粉碎及MICROS超細研磨粉碎均屬于低溫物理研磨的方法，可以把對DBM的生物活性的影響降低到最小限度。

影響DBM納米化的因素：

MICROS適用于各種無機物、有機物的粉碎，DBM也在其適用范圍內。影響MICROS粉碎后DBM顆粒粒徑大小的因素有DBM初始粒徑大小、MICROS主軸轉速、粉碎時間和材料濃度等。

由于MICROS研磨部件之間的間隙很小，材料的初始粒徑如果遠遠超過研磨間隙，則無法進入研磨間隙而得到有效研磨，因此DBM初始粒徑在微米級比較適宜。我們使用液氮冷凍球磨將DBM預粉碎至微米級，再由MICROS進一步粉碎。

MICROS主軸轉速越高，產生的離心力和剪切力越大，在相同時間里顆粒被粉碎得越小;當主軸轉速不變時，延長粉碎時間，顆粒的粒徑將逐漸變小。DBM濃度越大，顆粒之間的距離越小，剪切力可以更多的集中在顆粒上，從而在短時間內得到較小粒徑的顆粒;但是濃度過高將導致粘度過高、顆粒嚴重團聚，反而不利于納米化;濃度過低則降低了粉碎機的效率，加大了粉碎機的損耗。

納米DBM的生物相容性：

理想的骨移植替代材料應具有良好的生物相容性，即無毒性、無熱原性、不引起溶血反應，對周圍組織無刺激性，能被機體組織取代或被降解吸收。DBM經過國內外學者多年的研究，證實其具有良好的生物相容性。納米化的DBM顆粒僅改變了DBM的立體結構，因此也具有良好的生物相容性。本實驗通過急性毒性實驗、熱原實驗、溶血試驗等證實了DBM與納米DBM均是一種無毒、無刺激，不含熱源、無免疫原性的生物材料。

4 結論

納米DBM有良好的生物相容性，是一種無毒、無刺激，不含熱源、無免疫原性的生物材料;納米脫鈣骨基質可穩定的存在于溶液中，加上其表面的較高活性可使其能和其他復合物均勻、有效結合;納米DBM可按需要隨意塑形，塑形干燥后所得任意形狀的納米DBM具有很好的韌性和一定的延展性，在一定程度上滿足臨床植骨的力學要求。