作者：侯冬梅 池曉雷汪學英 尹凡

【摘要】 利用LangmuirBlodgett (LB)技術在氧化銦錫(ITO)電極上制備了二維納米金(nanoAu)單層膜，采用掃描電子顯微鏡表征了二維納米金單層膜。實驗結果表明：表面壓為28 mN/m時，可獲得分散性好、形狀規則且分布均勻的二維球形納米金單層膜。利用LB技術制備了肌紅蛋白(Mb)薄膜，并將其固定在二維納米金單層膜修飾的電極表面，研究了肌紅蛋白LB膜的直接電化學行為。結果表明：納米金粒子能夠有效地加速肌紅蛋白的電子轉移，其電子轉移速率為1.415 s-1。

【關鍵詞】 納米金單層膜， LangmuirBlodgett技術， 肌紅蛋白， 電子轉移速率

1 引 言

納米粒子的小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應及宏觀量子效應等導致納米粒子的熱、磁、光和敏感特性不同于常規粒子，這使得它具有廣闊的應用前景。由于納米金粒子具有較大的比表面，表面原子的巨大剩余成鍵能力使得納米金粒子較容易團聚、沉聚，所以須對其進行修飾與保護[1，2]，以實現對納米金粒子尺寸、粒徑分布和組裝維數的控制。其中二維有序納米金微粒陣列表現出獨特的電、磁和光學性質，在光學器件、超高密度信息儲存及納米電子器件等方面均有可觀的應用前景[3，4]。目前，二維納米材料單層膜陣列的組裝方法有LB技術[5，6]、自組裝[7]和電泳沉積[8]等，其中LB膜以其超薄、均勻有序、厚度可控、結構可任意設計以及在分子水平上能任意組裝的特點，成為獲得二維納米金有序單層膜的極好途徑。曲鵬等[9]采用LB技術制備了納米金粒子單分子膜;Chen[10]用雙硫醇分子在亞相表面處理納米金粒子單層膜，得到相互連接的二維納米金顆粒的網絡結構。

電化學生物傳感器因其潛在的應用價值而成為目前分析化學領域研究的熱點之一。在電極表面固定蛋白質的方法有吸附法、包埋法和共價鍵合法等。由于納米金生物兼容性好、易于電子傳遞等優點而被廣泛應用于電化學生物傳感器設計，例如利用納米金吸附固定辣根過氧化酶的H2O2生物傳感器[11，12]等。

本研究以化學還原反應制備納米金溶膠，實驗表明：表面修飾二十二酸甲酯的納米金粒子能在氣/液界面形成分散性好、形狀規則且分布均勻的二維球形納米金單層膜，用SEM表征所得的單層膜的表面形貌，并采用LB技術將制備的肌紅蛋白(Mb)單層LB膜修飾在二維球形納米金單層膜修飾的電極表面，研究Mb單層膜在其修飾電極上的直接電化學行為。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

612D型Langmuir槽(英國Nima公司);Parstat2273型電化學工作站(美國PE公司);CHI660c型電化學工作站(上海辰華儀器公司);S517型號掃描電子顯微鏡(日本日立公司);實驗采用三電極體系：飽和甘汞電極為參比電極，鉑片(7 mm ×2 mm)電極為輔助電極， ITO(3 cm×0.7 cm)電極為工作電極， ITO電極(長7 mm)之上用石蠟封住一部分，這樣就能保證每次使用的電極面積都一致。肌紅蛋白(BR，上海國藥集團化學試劑有限公司)，高氯金酸(AR，上海國藥集團化學試劑有限公司)， 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(含 0.1 mol/L KCl)，其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。實驗前用氮氣除氧30 min以上，實驗時保持氮氣氛圍并在室溫下進行 。

2.2 ITO基片的親水處理

依次將ITO基片放入V(乙醇)∶V(丙酮)∶V(氯仿)=3∶2∶1的混合液和二次蒸餾水中，在25 ℃下分別超聲清洗3次;然后將其放入質量濃度為20 g/L NaOH 溶液中超聲1 h。此時ITO基片表面呈親水性，清洗備用。

2.3 納米金氯仿溶液的制備

根據文獻[13]制備納米金溶膠，加入10 mg二十二酸甲酯于40 mL納米金溶膠中，再加10 mL氯仿，超聲萃取。納米金表面基本被表面活性劑所占據，納米金粒子表面為疏水性，能在氣/液界面形成單層膜，置于冰箱保存。

2.4 二維納米金單層LB膜的制備

亞相為二次蒸餾水，掛上Wilhelmy吊片，將親水ITO基片垂直插入水中。用微量注射器將納米金氯仿溶液均勻鋪于水面，待氯仿揮發后(約30 min)，納米金粒子能在氣/液界面形成穩定的Langmuir膜，設定壘壓縮速度為15 cm2/min，在壘壓縮過程中記錄等溫πA曲線。當膜壓達到設定值時，保持相同膜壓1 h，使Langmuir膜均勻穩定。在此膜壓下用垂直提拉法以1 mm/min的速度將其轉移到ITO基片上，即得二維納米金單層LB膜。

2.5 Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO電極的制備

將上述制備的ITO修飾電極垂直插入水中，先在氣/液界面上鋪展30 μL 1 g/L二十二酸甲酯，待其形成穩定的Langmuir膜，再將100 μL 1.5 g/L Mb均勻鋪在二十二酸甲酯Langmuir膜表面，待膜壓穩定一段時間后，以15 cm2/min速度壓膜，采用Z型LB膜法制備Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO電極，膜壓為50 mN/m，提拉速度為1 mm/min。 分 析 化 學第37卷第9期侯冬梅等：二維納米金單層膜的構建及其生物電化學應用

3 結果與討論

3.1 納米金單層LB膜πA等溫線

由于納米金的制備是在水相中進行，因此納米金粒子表面是親水性的。而用LB技術制備二維納米金單層膜，首先需對納米金粒子表面進行疏水處理。用過量的二十二酸甲酯對納米金粒子表面進行修飾使其為疏水性并于氯仿溶液中萃取，疏水性的納米金粒子能在氣/液界面上形成穩定的Langmuir膜。圖1分別為二十二酸甲酯修飾的納米金單層膜(曲線a)和二十二酸甲酯單層膜(曲線b)的πA曲線， 圖1 二十二酸甲酯修飾的納米金單層膜(a)和二十二酸甲酯單層膜(b)的πA等溫曲線， 亞相為二次蒸餾水

Fig.1 πA Isotherm of nanoAu modified with methyl docosanoate monolayer(a)and methyl docosanoate monolayer(b) on pure water surface可以看出兩條等溫曲線存在顯著的差異，說明納米金粒子的確存在于膜中。納米金單層膜在壓縮過程中出現氣態、液態和固態3種狀態，氣態時的納米金粒子處于隨機分散狀態，微粒間沒有相互作用，膜壓不隨膜面積減小而變化;液態時的膜壓隨膜面積減小而顯著上升，膜的可壓縮率變小;固態時的膜壓急劇增大，所有分子在亞相表面上都基本上成對地排列并密集充填形成穩定的單層膜，曲線幾乎呈垂直狀態。從圖1a可見，薄膜由液相轉換到固相時的膜壓約為26 mN/m。為獲得緊密有序的二維納米金單層膜，選擇膜壓為28 mN/m沉積納米金單層膜。

3.2 納米金單層LB膜的表面形貌

圖2是利用SEM對不同膜壓下獲得的二維納米金單層膜進行表征的結果。單層膜是由修飾了二十二酸甲酯的球形納米金粒子和游離二十二酸甲酯組成，這樣被修飾層包裹著的納米金粒子呈現各向均一的疏水性，并且納米金粒子表面基本被二十二酸甲酯所占據，而游離的二十二酸甲酯會有一定的相互嵌入，從而得到有序穩定的單層膜。由圖2b可見，表面壓為28 mN/m時可獲得分散性好、形狀規則且分布均勻的二維球形納米金單層膜，納米金粒子的平均粒徑約為15 nm。比較圖2a， 2b和2c可見，在不同膜壓下得到的納米金單層膜的表面形貌明顯不同。膜壓為18 mN/m時，ITO表面的納米金粒子較稀疏(圖2a); 在膜壓為28 mN/m時，納米金粒子間間距減小，粒子排列變得緊密，并且粒子分布均勻; 當膜壓為38 mN/m時，納米金粒子發生了重疊及團聚，薄膜的單層性很差，表面的缺陷顯著增加(圖2c)。因此，膜壓為28 mN/m時可獲得分布均勻和單分散性好的二維球形納米金單層膜。

3.3 納米金單層LB膜的表征

3.3.1 電化學循環伏安法 在2.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(含0.1 mol/L KCl)溶液中采用循環伏安法表征二維納米金單層膜。根據探針分子的氧化還原行為和修飾電極前后的峰電流變化，繪制裸ITO電極(圖3a)、二維納米金LB膜修飾的ITO電極(圖3b)和二十二酸甲酯LB膜修飾的ITO電極(圖3c)在探針[Fe(CN)6]3-/4-分子溶液中的循環伏安曲線。由圖3可見，裸ITO電極的氧化還原峰電流最大;當ITO電極表面修飾二十二酸甲酯單層LB膜后，氧化還原峰電流明顯降低，說明電極表面的二十二酸甲酯單層LB膜較為致密，對探針[Fe(CN)6]3-/4-分子形成了有效地阻礙;當二十二酸甲酯修飾的納米金LB膜修飾ITO電極時， 其電極的氧化還原峰電流遠大于二十二酸甲酯單層LB膜修飾電極的電流響應，表明納米金粒子有良好的導電性，其存在極大地提高了修飾電極的電子傳導能力。

3.3.2 電化學交流阻抗法 化學交流阻抗法(EIS)是用小幅度交流信號擾動電解池，觀察體系在穩態時擾動跟隨情況，是研究電極過程動力學及電極界面現象的重要手段[14]。圖4為3種不同修飾電極的交流阻抗曲線。采用R(C1R1)(QR2)(C3R3)電路模型擬合修飾電極的阻抗曲線，其中并聯的C3， R3分別代表電極表面修飾膜的雙電層電容和阻抗值。由擬合結果可知：裸電極阻抗值最小，約為48 Ω;表面覆蓋一層致密的二十二酸甲酯LB膜后，其阻抗值增加到1413 Ω，說明不導電的二十二酸甲酯LB膜有效阻止了溶液中帶電粒子與電極表面的接觸;而納米金膜修飾電極的阻抗值為389 Ω，這可能是由于納米金顆粒的存在使電極表面二十二酸甲酯LB膜存在缺陷，有利于帶電粒子通過。對于裸電極和二十二酸甲酯修飾電極，雙電層電容值均為1.0×10-6 F;而納米金修飾電極的雙電層電容值為1.0×10-9 F，與裸電極及二十二酸甲酯修飾電極相比，其雙電層電容值減小較多，這可能是由于納米金的隧道效應使電子易于透過納米金表面的水分子層或二十二酸甲酯層，從而降低了雙電層的充放電性能。

3.4 Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO電極的制備

蛋白質的固定化方法有吸附法、溶膠凝膠法、包埋法、交聯法等，這些方法制備的蛋白質薄膜的有序性和單層性均較差，而LB膜法制備的蛋白質單層膜具有高度各向異性的層狀結構并且在理論上幾乎是沒有缺陷薄膜，本研究小組提出了利用LB技術制備蛋白質復合膜的新方法，制備了Hb十八胺混合薄膜，并應用于雙氧水生物傳感器設計[15]。本研究采用LB技術制備肌紅蛋白混合LB膜并固定在電極表面。

將100 μL(1.5 g/L)Mb均勻鋪在30 μL (1 g/L)二十二酸甲酯形成的Langmuir膜表面，膜壓迅速上升，表明Mb分子已經進入二十二酸甲酯單層膜中。當膜壓到達平衡時，以壘速為15 cm2/min的速度壓縮混合薄膜，得到了πA等溫曲線(圖5A，曲線b)，與二十二酸甲酯單層膜的πA等溫曲線(圖5A，曲線a)相比，在一定膜壓下，Mb二十二酸甲酯混合薄膜的膜面積較大，說明Mb分子的確存在于二十二酸甲酯單層膜中。而Mb二十二酸甲酯混合薄膜等溫曲線上的平臺說明在壓縮過程中發生了相變，即由液相轉變為固相，此時的膜壓約為40 mN/m，而固相時分子排列較緊密，因此選擇50 mN/m作為混合薄膜的沉積壓。

3.5 Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO電極的直接電化學研究

圖5B為不同修飾電極在pH 7.0 PBS(含0.1 mol/L KCl)的循環伏安圖，其中nanoAu修飾電極(曲線1)未出現任何氧化還原峰信號，只出現了該體系的背景電流;Mb二十二酸甲酯混合薄膜修飾電極(曲線2)與Mb二十二酸甲酯/nanoAu修飾電極(曲線3)均出現一對明顯的氧化還原峰。陰、陽極峰電勢Epc和Epa分別為-0.138和-0.069 V，式量電位為E°′為-0.104 V，表明電化學響應源于所固載的Mb血紅素輔基中氧化還原中心Fe/Fe的氧化還原。陰、陽極峰電流比約為1，說明Mb的氧化還原是可逆的。而Mb二十二酸甲酯/nanoAu修飾電極的峰電流明顯大于Mb二十二酸甲酯修飾電極的峰電流，說明nanoAu確實對Mb的直接電子轉移起到了促進作用，同時納米金粒子的高表面能為Mb分子提供了一個特殊的、具有生物兼容性的微環境，能與底物分子發生特殊的具有選擇性的相互作用，提高了電極的電流響應。此外，納米金粒子又具有良好的導電性和宏觀隧道效應。因此，Mb和電極間可近似看作是一種導線聯系，從而快速促進Mb的氧化還原電活性中心與電極間電子轉移，有效地增大了電子轉移速率;因其具有較高的比表面積，納米金粒子的存在，能給Mb分子提供了更自由的取向，為Mb直接電子傳遞構筑更合適的方式，使其電活性中心更靠近導電性電極表面，從而更有利于電子傳遞反應的發生。

圖6A為Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO電極在0.1 mol/L pH 7.0 PBS(含0.1 mol/L KCl)中不同掃描速率下的循環伏安曲線。隨著掃描速率從40 mV/s增加到300 mV/s， 氧化還原峰電流與掃速呈線性關系(圖6B)，相關系數均>0.999，表明Mb的電化學反應為典型的表面控制的準可逆過程[16]，這進一步證明了Mb很牢固地固定在二維納米金單層膜修飾電極表面。另外，隨著掃描速率的增加，陰、陽極峰峰電位分別向正、負方向產生較小的偏移，ΔEp增加，但E°′幾乎不變。根據掃速與峰電位差的關系，利用有關電極表面異相反應動力學常數的計算方法[17]，可以得到Mb直接電化學反應的電子轉移速率常數κs為1.415 s-1。這一數值與文獻[18]報道的Mb電子轉移速率常數κs(0.41 s-1)相比大了3倍多，說明電極表面的微環境更有利于Mb的直接電子轉移。

4 結 論

其它方法制備的二維納米金有序單層膜通常在納米金粒徑控制、薄膜厚度及排布均勻性等方面存在一定的局限性，而LB技術可以采用顆粒大小一致的納米金在氣液界面形成納米金Langmuir膜，通過精確控制制膜條件來獲得二維納米金有序單層膜。實驗結果表明，利用本方法制備的納米金膜中納米金粒子分散均勻，且制備操作簡單，有望在納米電子器件的制備中發揮重要的作用。在后續研究中，將此技術應用于生物電化學傳感器研究。