作者：石維佳，保庭毅，楊增悅，邱建新，薛力，孫文美

【摘要】 目的：探討鈥激光(Ho:YAG laser)對腎腫瘤的毀損效應. 方法：制作兔的腎VX2腫瘤模型，在手術直視下采用不同鈥激光功率對腫瘤組織進行徹底照射. 觀察照射后腫瘤組織及周邊腎臟組織的病理變化，另外每組各5只于照射2 wk后處死，比較腫瘤的生長情況. 結果：鈥激光照射后立即行HE染色可發現腫瘤細胞發生凝固性壞死，損毀灶大小隨鈥激光的照射參數增大而增大，并有統計學意義. 在對照實驗中，所有5只照射組動物的腫瘤原發灶均被完全破壞，而對照組的腫瘤平均體積為(2645.5±174.2) mm3. 結論: 鈥激光對兔的腎VX2腫瘤組織有明顯殺傷作用，且有較好的可控性和操作性.

【關鍵詞】 鈥激光

0引言

鈥激光是由摻鈥的釔鋁石榴石激光器(Ho：YAG)產生的中紅外激光，因其具有良好的物理特性及生物學效應，目前已在臨床上得到了廣泛的應用［1-5］，然而尚無應用鈥激光治療腎腫瘤的研究報道. 我們擬通過動物實驗研究鈥激光對腎腫瘤的毀損效應.

1材料和方法

1.1材料成年健康新西蘭白兔30只，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg， 4～5 mo齡(第四軍醫大學實驗動物中心). VX2瘤株種類為VX2鱗狀細胞癌(第四軍醫大學唐都醫院實驗外科). HE染色系列試劑(第四軍醫大學病理教研室). 速眠新Ⅱ注射液（長春軍需大學獸醫研究所）. 磷酸鹽緩沖液(PBS)和40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4 APES). 石蠟切片機(美國A0829)；HE染色機(日本櫻花公司)光學顯微鏡BX60(日本Olympus公司)；IBAS2000型電子計算機圖像分析系統(德國Opton公司)；VersaPulse Powersuite 100W(美國科醫人公司)；SlimLine 550 micron Blue(美國科醫人公司)；Jacket Reusable Fiber和Sequoia512 型彩色超聲診斷儀（美國Acuson 公司）.

1.2方法

1.2.1動物模型的建立

1.2.1.1接種用VX2瘤株的準備把冰凍的VX2瘤株組織塊由液氮中取出，37℃水復蘇，生理鹽水沖洗，再用PBS液沖洗后切碎，300 r/min離心約5 min. 用18 G針頭l mL注射器抽吸瘤種備用. 將準備好的瘤種注射液注入兔的后腿外側肌肉，2~3 wk后可在注射部位捫及明顯的質地較硬的實質性腫塊，即制成了荷瘤種兔. 依次剪開皮膚、筋膜，暴露VX2腫瘤組織，取出一部分腫瘤組織，放入盛有生理鹽水的托盤內，去掉壞死的組織和筋膜，取生長旺盛的魚肉樣組織放入無菌燒杯中，加少量生理鹽水，用剪刀盡量剪碎，然后加適量生理鹽水制成腫瘤組織混懸液，無菌空針抽吸備用.

1.2.1.2兔腎VX2腫瘤動物模型的建立手術直視下腫瘤混懸組織液注射法（實驗兔全部采用左腎接種）：左腎區常規消毒鋪巾，在左肋緣下約2.3 cm處，依次剪開皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，暴露左腎，將腎臟輕輕擠出腹腔，將準備好的含腫瘤組織懸液的注射器從左腎下極進針，沿腎長軸在腎皮質內走行，邊退針邊將注射器中的腫瘤組織混懸液約0.5 mL輕輕推入腎皮質內，針尖退出的同時，助手用無菌明膠海綿壓迫止血并防止腫瘤組織溢出，然后將左腎放回原位，逐層縫合. 術后肌注青霉素4×105 U， 4 d. 接種12 d后行B超檢查種植腫瘤生長情況，未發現腫瘤生長者視為接種失敗.

1.2.2分組及處理將接種成功的荷腎VX2腫瘤兔26只隨機分為2組: ①實驗組：21只行鈥激光腫瘤毀損實驗. 根據分組提取動物，速眠新Ⅱ注射液0.2～0.4 mL，兔臀部肌肉注射，麻醉滿意后將兔右側臥并固定于操作臺上. 應用脫毛劑對手術區域進行脫毛處理；碘酒、酒精消毒腹壁；在左肋緣下約2.3 cm處做一長約8 cm的切口，依次剪開皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，充分暴露并游離左側腎臟，保持腎臟的良好血運；設置鈥激光參數如下：脈沖能量（1.0 J）、照射頻率（40 Hz），參數的選擇依據為鈥激光對正常腎實質的生物學效應［6］. 將鈥激光光纖頭端插入18 G針頭，在直視下置入腫瘤包膜下約0.5 mm深處. 大致損毀腫瘤后退出；隨機處死實驗組中16只動物，解剖左腎，觀察鈥激光損毀灶大致形態，用鋼尺測量損毀腫瘤，按公式π/ 6 長×寬×高計算損毀腫瘤體積［7］，記錄對應之鈥激光總功率. 以損毀灶為中心，每隔1 mm切取組織至肉眼觀正常腎組織處，后置于40 g/L甲醛固定、石蠟包埋、切片，進行HE染色; 未被處死的5只荷瘤兔待腎臟止血后，逐層縫合腹膜、皮下組織及皮膚. 術后青霉素4×105 U， im， 3 d，2 wk后處死取左腎. 觀察腫瘤生長情況，并同上做HE染色病理檢查. ②對照組：5只行假性治療. 同樣方法麻醉后開腹，在直視下將18 G針頭置入腫瘤包膜下約0.5 mm深處. 不接鈥激光治療儀，拔除針頭待腎臟止血后關腹. 術后青霉素4×105 U， im， 3 d，2 wk后處死取左腎. 觀察腫瘤生長情況，同上測量并計算腫瘤體積并做HE染色病理檢查.

1.2.3HE染色、電子計算機圖像分析系統分析將HE染色的切片在光學顯微鏡下觀察組織細胞學改變情況，顯微照相系統拍片，病理切片用圖像放大裝置及CCD相機轉換為電信號，采用電子計算機圖像分析系統進行熱損傷帶厚度的測量.

1.2.4觀察指標①鈥激光作用于腎腫瘤的肉眼觀察；②鈥激光損毀灶的體積及相應鈥激光總功率；③組織病理學改變的觀察；④對照組腫瘤體積的測量及病理學改變.

統計學處理: 數據以x±s表示，選用SPSS 11.0統計軟件進行統計分析，采用成組t檢驗及直線回歸及相關性分析.

2結果

2.1動物模型的建立情況有26只種植腫瘤成功，并經病理證實，接種成功率86.7%. 瘤灶中心均位于腎皮質內，除1只有2個瘤灶外，其他均只有1個瘤灶，瘤灶位置不固定，腎上、下極均有瘤灶發現. 瘤灶大小不固定.

2.2大體觀察在鈥激光處理時可見腫瘤結節表面的顏色由灰白色變為白色的凝固斑，中間可見氣化的豁口，外圍有一圈充血淤血帶. 有少量出血、濺血現象，多在1~2 min內自行停止. 無尿瘺發生. 解剖腎臟可見靶區內中央灰白色魚肉樣腫瘤組織變為白色凝固性壞死灶，界限清楚，中間為汽化的缺損區，汽化區外為熱損傷帶.

2.3組織學檢查鈥激光照射后，光學顯微鏡下可見淺層為變性壞死帶，腫瘤細胞形態消失、核固縮、碎裂、融解，照射范圍足夠可觀察到深層為正常腎組織的充血瘀血帶，腎靜脈擴張、瘀血，可見較多的炎細胞浸潤和小片狀出血和血栓形成，腫瘤細胞少見，充血瘀血帶與正常組織分界清楚(圖1A，B). 部分細胞核完全破裂，僅見胞質內核基質成分. 電子計算機圖像分析：全部病理切片經電子計算機圖像分析顯示，毀損灶外周熱損傷帶寬度均在400～800 μm之間(540±33) μm，照射時間的長短對熱損帶寬度均無影響. 汽化豁口兩側和底部的熱缺損帶寬度無差異.

圖1兔腎VX2腫瘤經鈥激光照射后病理表現略

2.4鈥激光損毀灶的體積及相應鈥激光總功率間的關系隨著激光輸出功率的增大腫瘤組織損傷灶亦增大. 應用SPSS軟件繪制散點圖，進行直線相關及回歸分析，表明兩者之間有良好的相關性（r=0.9521， t=12.06， P=0.000，圖2）.

圖2鈥激光總功率與損傷腫瘤組織大小關系散點圖略

2.5對照實驗實驗組及對照組的腫瘤體積分別為(1025.4±156.3)， (2645.5±174.2) mm3，兩者差異顯著(P<0.01). 行病理學檢查見實驗組腫瘤組織已被完全破壞，鏡下觀同上. 對照組病理切片低倍鏡下可見腫瘤與腎實質無明顯邊界的浸潤性癌巢，癌細胞排列緊密呈實體巢狀，纖維間隔少．新生毛細血管豐富．間質內散在淋巴細胞、漿細胞，并于鄰近腎組織中可見散在的小癌巢和血管內瘤栓；高倍鏡下見癌細胞染包深，大小和形態不一，胞漿豐富呈淡紅染色，未見角化珠；核大而圓，大小、形態不一，異形性明顯，核膜清楚，染色.

3討論

VX2腫瘤起源于Shope病毒誘導的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，是一種可移植的腫瘤細胞株［8］. 其組織類型雖為鱗癌，與臨床上最多見的腎癌類型不盡相同，但利用其制成的動物模型仍為目前研究腎腫瘤的最佳途徑. 基于腎癌對放射治療和化學治療不敏感，目前對腎腫瘤的常規外科治療為腎切除術. 但在有些情況下，如孤立腎癌、對側腎功能低下、雙腎癌、手術不能耐受者、患者要求保留腎臟等，顯然并不適合行腎切除術. 目前針對如上情況一般采用腎部分切除術或是腫瘤剜除術，然而這兩種手術均存在手術復雜、難度大、技術要求高、術中出血多、術后并發癥多等缺點. 因此探索一種介入或是微創的手術治療方法，在腎腫瘤的外科治療中有著相當的意義. 鈥激光的波長2120 nm，非常接近水的1950 nm吸收峰，其吸收系數為24 cm-1，能很好地被生物組織吸收. 高功率的鈥激光被生物組織中的水分吸收后，在其光纖頭端產生溫度極高(可以使金屬熔化)、具有很高壓強和沖擊力的等離子泡［9］，使組織汽化、切割，而離子泡周圍傳導的熱量可使組織凝固壞死、凝血. 較低功率的鈥激光則通過組織直接吸收光能產生熱凝固效應. 鈥激光的醫學應用特點：①由于生物組織的熱傳導系數小，因此鈥激光導致的熱凝固損傷的范圍是一定的. 穿透深度淺，組織穿透度<0.5 mm，可用于精確的外科切割和止血；② 高能脈沖式. 因為鈥激光的這種生物學特性，在臨床各科室中已有了相當的應用，而其在腫瘤治療中的有效性和可行性研究也有一定的報道. 我們利用鈥激光的這種生物學特性，以制作的兔腎VX2腫瘤動物模型為實驗對象，根據實驗結果，證實了鈥激光在腎腫瘤治療中的有效性和可行性. 采用照射強度參考了其對正常兔腎實質的生物學效應劑量，發現隨著激光輸出功率的增大腫瘤組織損傷灶亦增大. 在對治療組的全層切片檢查中，可見腫瘤原發組織被完全破壞. 在與對照組的比較中可見兩者顯著不同. 病理切片的電子計算機圖像分析顯示，在腫瘤組織汽化區外圍的熱損傷帶寬度較固定，均在400～800 μm之間，且汽化豁口四周的熱損傷帶寬度與豁口底部的熱損傷帶寬度相比無明顯差異，另外，熱損傷帶之外的正常腎組織切片檢查未見明顯損傷，表明了鈥激光的負損傷小. 利用鈥激光對腎腫瘤進行治療具有臨床價值. 既可以在影像技術的引導下行穿刺介入治療，也可以在保腎手術中輔助切割，或者通過腹腔鏡進行治療.

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