作者：張向陽 門金娥 鄭海萍 田珂 劉建霞

【關鍵詞】 激光掃描共聚焦;顯微鏡；腫瘤；消化道

【關鍵詞】 激光掃描共聚焦;顯微鏡；腫瘤；消化道

0引言

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）是當今世界上最先進的分子細胞生物學分析儀器［1］. 使用鈣高度特異性熒光指示劑Flou3/Am能觀察到細胞內Ca2+濃度變化. 大量實驗證明，在多種刺激因子作用不同細胞誘導凋亡或病理條件下細胞自發凋亡的過程中，都普遍存在胞質鈣的持續升高［2］. 我們通過LSCM檢測化療藥物引起賁門腫瘤細胞Ca2+濃度的變化，并同用MTT法測得的藥敏結果比較，以探討Ca2+濃度變化與藥敏的關系.

1材料和方法

1.1材料標本均來源于河北工程學院附屬醫院手術切除的賁門腫瘤組織；MTT(Sigma公司)；RPMI1640(Gibco公司)；Flou3/Am(Biotium公司)；順鉑(山東省德州制藥廠)；甲氨蝶呤(北京醫科大學實驗藥廠)；阿霉素(明治醫藥有限公司)；絲裂霉素(上海新亞藥業有限公司)；5氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業有限公司)；LSCM MRC1024(BioRad)；二氧化碳培養箱（Sanyo公司）.

1.2方法將腫瘤組織置入含RPMI1640培養液的無菌器皿中，機械方法制成細胞懸液，調整細胞密度為（1～3）×108/L. 將細胞懸液接種于96孔培養板（90 μL/L），置50 mL/L CO2， 37℃二氧化碳孵箱內培養4 h，分2組分別加入順鉑、甲氨蝶呤、阿霉素、絲裂霉素和5氟尿嘧啶5種化療藥物（10 μL/孔），并設空白孔和對照孔. 繼續培養12 h后取一組96孔板，收集細胞液，加入50 μL Fluo3/AM (10 μmol/L)， 繼續孵育1 h，洗去多余的Fluo3/AM，用LSCM檢測細胞內Ca2+濃度變化. 細胞培養72 h后，取一組96孔板，棄去上清，每孔加入2 g/L MTT 20 μL，繼續培養4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μL，室溫振蕩10 min，用酶標儀（λ=550 nm）測定每孔吸光度（A）值. 相對抑制率（%）=（對照組A-加藥組A）/對照組A×100%，相對抑制率≥30%為敏感，相對抑制率＜30%為不敏感. 數據采用PEMS3.1軟件進行Wilcoxon秩和檢驗.

2結果

化療藥物引起的賁門腫瘤細胞內Ca2+濃度變化與藥敏關系見表1. 敏感藥物與不敏感藥物引起的賁門腫瘤細胞Ca2+濃度變化之間具有顯著差別（P<0.05），敏感藥物引起的賁門腫瘤細胞內Ca2+的濃度變化明顯大于不敏感藥物. 表1賁門腫瘤細胞內Ca2+濃度的變化與MTT藥敏結果比較（略）

3討論

研究證明，目前使用的許多抗癌藥均可在不同類型的敏感腫瘤細胞中誘導凋亡. 藥物的抗腫瘤效果不僅取決于藥物對靶細胞的直接作用，更在于其誘導敏感腫瘤細胞凋亡的能力. 化療誘導細胞凋亡的機制分三個階段， 在最后一個階段，化療藥物僅能使對其敏感的細胞而非耐受細胞產生凋亡的bax基因表達，最后導致凋亡發生，選擇敏感藥物誘導細胞凋亡成為化療的目的. Ca2+作為參與許多生命活動的關鍵第二信使，在細胞凋亡中的作用受到普遍關注［3］. Ca2+本身就是一種誘導細胞凋亡的信號，已得到多方面的證實.

臨床抗癌藥物篩選常用MTT比色法，但MTT比色法需3 d時間，在藥敏結果出來之前，患者的用藥在很大程度上尚靠經驗去選定化療藥物. 發生凋亡的細胞最早可以測及的生物變化是細胞內快速持續的Ca2+濃度的升高，我們使用化療藥物作用賁門腫瘤細胞后，將LSCM檢測的Ca2+濃度變化與MTT法測得的藥敏結果相比較，結果顯示與不敏感藥物相比，敏感藥物能引起賁門腫瘤細胞Ca2+濃度的更大變化，通過LSCM檢測化療藥物誘導后賁門腫瘤細胞Ca2+濃度變化，可以在MTT藥敏結果出來之前為臨床用藥提供參考.

【參考文獻】

［1］ 王春梅，黃曉峰，李玉松，等. 激光共聚焦顯微鏡與熒光顯微鏡在醫學研究中的比較［J］. 第四軍醫大學學報， 1997， 12: 62-63.

［2］ Nicotera P，Orrenius S. The role of calcium in apoptosis［J］. Cell Calcium， 1998，23(23):173-180.

［3］ Rizzuto R， Pinton P， Ferrari D， et al. Calcium and apoptosis:facts and hypotheses［J］. Oncogene， 2003，22(53):8619-8627.