【摘要】 通過(guò)丁二酸酐將失水山梨醇脂肪酸酯(Span80)和聚乙二醇(PEG400)聯(lián)接在一起，合成了一種新的非離子表面活性劑。然后將其嫁接在聚乙烯醇(PVA)化的Fe3O4磁性粒子上，合成了一種新型靶向藥物載體。這種載體兼?zhèn)淞薙pan80/PEG400類脂囊泡和磁性材料的特點(diǎn)，具有良好的穩(wěn)定性和靶向作用。將這種新型載體用于兩性霉素的包封，包封率可達(dá)96.6%，且方法簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用了FTIR， NMR， XRD和TEM等多種手段進(jìn)行表征。

【關(guān)鍵詞】 失水山梨醇脂肪酸酯; 聚乙二醇; 聚乙烯醇; 藥物載體; 磁性粒子

1 引 言

納米微粒四氧化三鐵是一種磁性強(qiáng)、制備相對(duì)簡(jiǎn)單且生物相容性較好的磁性粒子，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常采用的磁性載體材料[1]。將有機(jī)高分子和這種磁性物質(zhì)結(jié)合后會(huì)形成具有一定磁相應(yīng)性及特殊結(jié)構(gòu)的微球，其既可以通過(guò)共價(jià)鍵來(lái)結(jié)合酶[2，3]、細(xì)胞[4]等生物活性物質(zhì)，或作為藥物的載體[5]和固相吸附材料[6～8]等;又可對(duì)外加磁場(chǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的磁相應(yīng)性。目前，用于磁性材料的有機(jī)高分子主要有殼聚糖[9]、血清白蛋白[10]等。而用非離子表面活性劑改性的磁性材料少有報(bào)道[11]。

失水山梨醇脂肪酸酯(Span80)和聚乙二醇(PEG400)復(fù)配形成的類脂囊泡可作為藥物助劑，長(zhǎng)期穩(wěn)定存在[12]。本實(shí)驗(yàn)合成了Span80PEG400，將其成功地嫁接在磁性粒子上。將聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol， PVA)羧基化(PVAc)，然后將PVAc涂層在磁性粒子表面，制備出一種新型的靶向藥物載體，并將此載體用于兩性霉素的包封，效果良好。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EQUINX55傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司);UitraShied 300M核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司);XPERTPRO X射線衍射儀(荷蘭飛利浦公司); TU1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司);H800透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯(Tween 20)、Span80、PEG400、PVA和丁二酸酐為分析純?cè)噭?4二甲氨基吡啶(4DMAP， 99%)，N，N′二環(huán)己基碳二亞胺(DCC， 99%)購(gòu)于上海 Medpep公司;其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.2 磁性微球的制備

2.2.1 Span80PEG400的合成 取干燥圓底燒瓶，加入反應(yīng)溶劑二氯甲烷(CH2Cl2) 200 mL，Span80 21.4 g (0.05 mol)，丁二酸酐(Succinic anhydride)15 g(15 mol)，及催化劑4DMAP 6.1 g (0.05 mol)，于65 ℃水浴攪拌下反應(yīng)12 h。冷卻后抽濾除去未反應(yīng)的丁二酸酐，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液除去CH2Cl2后得Span80的酯化產(chǎn)物。在200 mL CH2Cl2中，按照摩爾比1∶1∶1∶1分別加入PEG400、Span80的酯化物、DCC及催化劑4DMAP，室溫下磁力攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾除去DCC，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后加幾滴四氫呋喃于冰箱中保存過(guò)夜。

2.2.2 Span80PEG400嫁接的PVA化磁性粒子制備 稱取適量Span80PEG400倒入三口燒瓶中，加50 mL甲苯為脫水劑，攪拌溶解后，加入適量Fe3O4PVAc，再加入少量H2SO4作催化劑，加熱回流反應(yīng)3 h后停止。棄去甲苯液，用無(wú)水乙醇洗脫粘附在燒瓶壁上的黑色產(chǎn)物，用乙醇沖洗多次后蒸去乙醇，產(chǎn)物置于50 ℃真空干燥后備用。

2.3 新型靶向制劑作為兩性霉素的載體

將Fe3O4PVAcSpan80PEG400和水或者一定濃度的兩性霉素(AmB)的藥物溶液按照質(zhì)量比1∶99配制，超聲15 min后[12]，各取1.00 mL裝于透析袋中，在25 mL水中透析24 h，測(cè)定AmB在407.0 nm處的吸光度，扣除空白的吸收，由工作曲線確定游離藥物的濃度，根據(jù)EE(%)=(c總-c游離)/c總×100計(jì)算包封率[10]。

3 結(jié)果與討論

3.1 磁性靶向載體的合成及表征

3.1.1 Fe3O4PVAc微球的合成及表征 參照文獻(xiàn)[13] 合成了Fe3O4PVAc磁性微球。對(duì)比紅外差譜可知，F(xiàn)e3O4PVAc即具有FeO在570 cm-1左右的特征吸收峰，又含有1617 cm-1的羰基吸收峰和1049 cm-1處的醚鍵的吸收峰， 其結(jié)果與文獻(xiàn)[13]相符。此外，在13CNMR中，δ 163.23×10-6的峰確定為PVAc的羰基所致。由此可知，PVAc已成功嫁接在Fe3O4粒子表面。

采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察Fe3O4納米粒子及Fe3O4PVAc的微觀形態(tài)。由圖1A可見(jiàn)，共沉淀法制備得到的Fe3O4納米粒子主要為球形結(jié)構(gòu)，粒子大小均勻。粒子的直徑約20 nm。其表面包覆后形成的Fe3O4PVAc的形貌見(jiàn)圖1B。包覆后的團(tuán)聚現(xiàn)象減弱，有部分分散的趨勢(shì)。

Fe3O4在XRD圖譜中有6個(gè)特征衍射峰(220， 311， 400， 422， 511和440)，這些指標(biāo)參數(shù)在圖2中的兩個(gè)譜線里都能觀察到，說(shuō)明合成的Fe3O4納米微粒具有尖晶石結(jié)構(gòu)，且在表面包覆時(shí)無(wú)相變現(xiàn)象。

3.1.2 Span80PEG400嫁接的磁性微球的制備及表征 Span80PEG400的合成分為兩步，均為酯化反應(yīng)，其反應(yīng)原理如下:

由A和B的分子結(jié)構(gòu)可知，B結(jié)構(gòu)式上多了一個(gè)雙羰基(丁二酸酐打開(kāi)所致)。而反映在FTIR光譜上(未列出)，就是在1740和1850 cm-1之間有雙峰(OCOCH2CH2COOH)。此外，采用1H NMR(CDCl3)對(duì)所得產(chǎn)物B的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，其中，與羰基相連的兩個(gè)亞甲基(OCOCH2CH2COOH)的化學(xué)位移出現(xiàn)在δ 2.61處，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的結(jié)果一致，證實(shí)了B的存在。產(chǎn)物C的紅外譜圖與B相比，多了1109 cm-1處的νas(COC)和952 cm-1處的νs(COC)。此外，在Span80PEG400的1HNMR(CDCl3)譜圖上(未列出)， δ 4.21處出現(xiàn)的亞甲基源于PEG400，且與琥珀酰基(Succinyl group)相連，而δ 3.56處的峰則為PEG400分子結(jié)構(gòu)中的重復(fù)單元。證實(shí)了通過(guò)丁二酸酐Span80已成功連接上PEG400。在靶向制劑Fe3O4PVAcSpan80PEG400的紅外圖譜中， FeO鍵(570 cm-1)，羰基(1680 cm-1)，特別是醚鍵的(1100～1200 cm-1)峰明顯增強(qiáng)，由此可知已成功制備了改性的磁性微球。

3.2 新型靶向制劑包封兩性霉素及結(jié)果分析

兩性霉素是治療深部真菌感染的首選藥物之一，但該藥物具有嚴(yán)重毒性，使臨床應(yīng)用受到很大限制。由此，對(duì)這類藥物的包封和控制釋放是提高療效、降低毒副作用最有效的方法。按照2.3節(jié)所述方法，用Fe3O4PVAcSpan80PEG400作為兩性霉素藥物的載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為了解其包封效果，需建立在此體系下兩性霉素藥物的檢測(cè)方法。由于是磁性載體，在磁場(chǎng)作用下，很容易實(shí)現(xiàn)載體與未包封藥物的分離和測(cè)定。

3.2.1 脂質(zhì)體的吸收光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線 以無(wú)水乙醇為溶劑配制較低濃度的兩性霉素溶液，以無(wú)水乙醇為參比，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在300～700 nm內(nèi)掃描，在407 nm處出現(xiàn)最大吸收。而空白脂質(zhì)體和包封藥物的脂質(zhì)體的紫外吸收光譜表明，在407 nm處測(cè)定時(shí)，空白脂質(zhì)體幾乎無(wú)吸收，故不影響藥物的測(cè)定(見(jiàn)圖3)。 圖3 脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體的紫外吸收光譜圖

配制濃度分別為0.5， 1.0， 2.0， 3.0和4.0 mg/L的兩性霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在407 nm處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定兩性霉素的線性回歸方程為：A=-0.3818+0.08866c(r=0.99883， n=5)。

3.2.2 兩性霉素的包封及誤差分析 當(dāng)Fe3O4PVAcSpan80PEG400和0.25 g/L兩性霉素(AmB)的藥物溶液按照不同質(zhì)量體積比配制時(shí)，包封率見(jiàn)表1。隨著質(zhì)量體積比的增加， 包封率也在逐漸增大;但質(zhì)量體積比達(dá)到一定值后再增大，包封率變化不大，最大包封率為96.6%，高于Span80和PEG400制備的囊泡[12]的包封率95.2%。但由于其具有磁鐵靶向性，結(jié)果令人滿意。需要說(shuō)明的是，由于這種新型磁性粒子具有兩性分子的特點(diǎn)，可用于磁性囊泡等的自組裝[15]和作為分離富集的載體等，相關(guān)的工作有待于進(jìn)一步的研究。 表1 在不同質(zhì)量體積比條件下AmB藥物在Fe3O4PVAcSpan80PEG400中的包封率