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摘要：本研究旨在建立能同時(shí)檢測(cè)豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、壞死梭桿菌(Fn)和副豬嗜血桿菌(Hps)7種豬場(chǎng)常見(jiàn)高致死性流行病原的多重PCR檢測(cè)方法。利用7種病原體的保守序列設(shè)計(jì)7對(duì)特異性引物,同時(shí)合成了Cy-5標(biāo)記的通用引物。將通用引物分別連接到特異性引物的5′端形成7對(duì)特異性嵌合引物。優(yōu)化反應(yīng)條件,分別使用7組嵌合引物和通用引物混合,擴(kuò)增7種病原的混合cDNA/DNA,驗(yàn)證其單重PCR的特異性。利用GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng),混合7種嵌合引物和通用引物,擴(kuò)增單一病原的cDNA/DNA,驗(yàn)證其多重PCR特異性;將其他常見(jiàn)豬病病原的基因組作為干擾的陽(yáng)性標(biāo)本,利用7對(duì)混合嵌合引物和通用引物進(jìn)行多重PCR分析,擴(kuò)增加入了陽(yáng)性標(biāo)本的混合模板,驗(yàn)證其多重PCR的抗干擾能力。利用重組質(zhì)粒和體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行梯度稀釋,確定GeXP多重檢測(cè)體系的靈敏度。結(jié)果表明,7種不同引物分別進(jìn)行GeXP單重及多重檢測(cè),均能檢測(cè)出特異性目的片段的信號(hào),無(wú)明顯的干擾片段信號(hào)出現(xiàn);GeXP多重檢測(cè)抗干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示,在混入3種干擾病原模板后,依然可同時(shí)特異性檢測(cè)出7種病原;GeXP多重檢測(cè)靈敏度分析顯示,在10~3拷貝/μL濃度條件下能檢測(cè)到7種不同基因的特異性結(jié)果。本研究建立的同時(shí)檢測(cè)7種豬場(chǎng)常見(jiàn)高致死性流行病原的GeXP檢測(cè)方法具有高通量、高特異性和高靈敏度的特點(diǎn),為快速診斷豬流行性疾病的交叉感染和混合感染提供了新型的檢測(cè)方法。

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