基因治療對(duì)ALI治療效果的影響

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基因治療（基因治療）是指通過載體將外源性正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以達(dá)到治療目的，從而糾正或彌補(bǔ)基因缺陷和異常引起的疾病。即通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源性基因插入患者適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，使外源性基因產(chǎn)生的產(chǎn)物能夠治療某些疾病。基因被載入細(xì)胞表達(dá)的載體包括病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體分為腺病毒。與腺病毒有關(guān)的病毒。反向記錄病毒載體等；非病毒載體包括脂質(zhì)體.磷酸鈣.基因槍等。腺病毒是基因治療的主要載體，并在所有基因治療研究中占28%[1,2]。急性肺損傷(ALI)是一種常見的危重疾病，嚴(yán)重威脅生命安全，其死亡率在我國高達(dá)60%~70%。傳統(tǒng)的ALI治療方案僅限于挽救生命和疾病，因此，嘗試基因治療等新治療方法已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。然而，以其為載體的基因治療對(duì)ALI治療效果的影響對(duì)于腺病毒本身的炎癥作用是罕見的。本研究觀察了腺病毒感染和炎癥作用對(duì)小鼠ALI基因治療效果的影響和意義，并建立了小鼠ALI疾病模型。

1材料和方法。

1.1物質(zhì)動(dòng)物：本研究所研究使用的小鼠均經(jīng)美國賓夕法尼亞大學(xué)動(dòng)物部批準(zhǔn)。小鼠的隨機(jī)性分為4組:(1)吸氧前對(duì)照組(Con組)15組;(2)腺病毒治療組(AdLAZ組)標(biāo)記的20只;(3)磷酸鹽緩沖液(PBS組)治療組(PBS組)20只;(4)無治療組(無治療組)20只。

方法1.2。

1.2.1在100%O2暴露前兩天，通過鼻道的治療方法將腺病毒濃縮制劑的緩沖劑根據(jù)小鼠的體重調(diào)整每只小鼠50μL，并將總?cè)萘糠譃樗拇危?dāng)小鼠在麻醉狀態(tài)下處于垂直位置時(shí)，通過鼻腔吸入。

1.2.2高氧性肺損傷模型的每一組小鼠在隨機(jī)取樣后，將其暴露在100%O2灌注的氧氣艙中，同時(shí)制作高氧性肺損傷動(dòng)物模型。氧氣艙內(nèi)的氧流量為6~8L/min，艙內(nèi)的氧交換頻率為6~7次/h，CO2為0.2%，濕度約為45%，日間交替，夜間交替，約12小時(shí)。分別收集肺組織和肺泡灌洗液等標(biāo)本，用于檢測(cè)100%O2吸入后的24.48和72小時(shí)。

1.2.3標(biāo)本在高氧吸入前后的24.48和72h進(jìn)行收集和處理，應(yīng)用苯巴比妥(50mg/kg)腹部深麻醉小鼠，暴露小鼠主氣管并行氣管插管和機(jī)械通氣。沿胸腹中線切開皮膚和腹部皮下組織，暴露腹部器官和腹部主動(dòng)脈。為了減少肺部血流，分隔腹部主動(dòng)脈放血，然后打開胸部，分離心臟和肺旁結(jié)締組織，通過右心室穿刺。肺泡灌注液通過右心室灌注肺組織，水壓為20~30cmH2O(1cmH2O=0.098kpa)，直至肺組織血液清洗干凈。分離出來的肺組織在液氮中迅速冷藏，并將肺標(biāo)本保存在-80℃的冰箱中備用。此外，在機(jī)械通氣后和肺泡灌注前，用注射器對(duì)肺泡進(jìn)行3次灌洗，并收集支氣管-肺泡灌洗液。肺組織通過4%的主氣管進(jìn)入肺泡中的甲醛溶液，以備用于肺組織的細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.4X-gal染色β-半乳糖酶染色[4]可提供LacZDNA集成到肺上皮細(xì)胞DNA后的蛋白表達(dá)分布的影像學(xué)分析。在X-gal復(fù)合試劑（K4Fe（CN）6-3H2O，K3Fe（CN）6，2mgMGCL2an0.5mg/mlofeX-gal）中，新鮮的整體肺組織固定并完全漂洗后，可在X-gal復(fù)合試劑（K4Fe（CNe）6-3H2O，K3Fe（CNe）6和2mgMGCL2and0.5mg/mlofex-gal）中過夜孵化。第二天，在PBS漂洗后，觀察肺組織X-gal顏色后的藍(lán)色深度和范圍，并記錄下來。染色后的整體肺組織通過10%.20%和30%蔗糖溶液依次再次固定。然后，肺組織被埋葬在OCT復(fù)合物中，并在液氮中快速冷凍。沿著氣管縱軸將肺組織切成厚度為10米的片段；核紅試劑復(fù)合染色后，可在熒光顯微鏡下觀察（200倍）。

1.2.5β-半乳糖酶活性測(cè)定[5]10mg肺組織在0.25mol/LTris-HCl均勻漿緩沖液中快速均勻漿。200μl鄰硝基酚半乳糖反應(yīng)底化合物和900μl含有-巰基乙醇的裂解試劑混合均勻后，加入100μl肺組織均勻漿，在37℃下孵化，產(chǎn)生O-硝基吡喃（ONP）。該產(chǎn)品可在波長420nm的分光光度計(jì)中測(cè)定。同時(shí)，肺組織均勻漿中的蛋白質(zhì)濃度是通過牛馬球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物來確定的。β-半乳糖酶的活性表達(dá)是單位/毫克蛋白(U/mg)。

1.2.6通過苯巴比妥腹腔深麻醉，肺干/濕重比測(cè)定小鼠接觸氣管并行氣管插管和機(jī)械通氣。打開胸部后，肺組織將直接保留。在肺組織外液體迅速吸收后，稱重記錄為肺濕重，并送至干燥盒烘干。大約72小時(shí)后，記錄為肺干重。

1.2.7通過氣管插管收集支氣管-肺泡灌洗液，測(cè)量小鼠肺泡洗液中支氣管-肺泡洗液中支氣管-肺泡洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液中支氣管洗液。

1.3統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表達(dá)方式為(x±s)。顯著差異分析采用美國Sigmastat統(tǒng)計(jì)分析軟件，兩組之間顯著差異統(tǒng)計(jì)分析采用T檢驗(yàn)；多組之間顯著差異統(tǒng)計(jì)分析采用WayANOVA檢驗(yàn)。

　　2結(jié)果

2.以腺病毒為載體的LacZDNA在肺內(nèi)轉(zhuǎn)染的分布和表達(dá)活性小鼠在100%O2吸入前2天經(jīng)鼻吸入裝載LacZDNA的腺病毒，并在100%O2吸入開始時(shí)采集標(biāo)本并應(yīng)用X-gal染色，以了解LacZ基因在肺內(nèi)轉(zhuǎn)染的分布情況；同時(shí)，在100%O2吸入開始時(shí)和24.48小時(shí)和72小時(shí)分別采集肺組織，以測(cè)量LacZDNA表達(dá)蛋白β-半乳糖酶的活性。X-gal染色結(jié)果顯示，LACZDNA可以在全肺和肺各級(jí)支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的廣泛轉(zhuǎn)染和分布如藍(lán)色顆粒(圖1A.B)；在高氧吸入24.48和72h之前，可以測(cè)量LACZDNA的蛋白表達(dá)產(chǎn)物β-gal的活性，同時(shí)，在高氧吸入72h之后，該蛋白表達(dá)仍然保持在高氧吸入前的2倍以上(表1)。表1β-半乳糖酶的活性。

2.2腺病毒載體在高氧性肺損傷基因治療中的炎癥作用，隨著高氧暴露時(shí)間的延長，肺干/濕重比呈時(shí)間-依賴性增加。100%O2吸入48小時(shí)后，與無治療組小鼠相比，Adlacz組小鼠的肺干/濕重比有明顯差異；然而，在繼續(xù)吸入24小時(shí)O2之后，盡管Adlacz組的肺干/濕重比仍然保持在較高水平，但與其他兩個(gè)對(duì)照組相比沒有顯著差異（圖2）。與高氧吸入24小時(shí)和48小時(shí)的非治療組相比，Adlacz組小鼠支氣管-肺泡灌洗液中的蛋白質(zhì)濃度差異顯著；在高氧吸入72小時(shí)后，每組小鼠支氣管-肺泡灌洗液中的蛋白質(zhì)濃度基本保持相似水平。