作者：孫海波 李靜 安鼎偉 陳麗 張照果

【摘要】 目的 探討RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默STAT3基因表達(dá)對人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 采用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞增殖，RTPCR、Western blot及免疫組化法分別觀察STAT3基因和蛋白的變化，流式細(xì)胞儀及AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果 pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質(zhì)粒對大腸癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，與空白組及陰性組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在重組質(zhì)粒組，STAT3基因mRNA及蛋白的表達(dá)與空白組及陰性組相比明顯減低(P<0.05);重組質(zhì)粒可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期分期示細(xì)胞阻滯于G2期。結(jié)論 pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質(zhì)粒可抑制STAT3基因在人大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 STAT3;RNA干擾;大腸癌;基因治療

大腸癌發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素的影響〔1〕。傳統(tǒng)的放療、化療及手術(shù)治療仍不能獲得理想的效果，而基因治療逐漸成為大腸癌研究的熱點。轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)子與激活子家族(signal transducers and activators of transcription，STAT)的重要成員STAT3，其信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，目前將其定義為癌基因〔2〕。本文通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制STAT3基因在人大腸癌細(xì)胞HCT116中的表達(dá)，觀察其對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為大腸癌基因治療提供有效靶點及技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 AntipSTAT3(Y705)、βactin兔抗人多克隆抗體購自cst公司。人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。轉(zhuǎn)染試劑siPORT NeoFX購于Ambion公司，IMDM、胎牛血清購自Gibco公司，常規(guī)試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心提供。pSilencer1.0U6STAT3siRNAGFP重組質(zhì)粒由本室保存，超純質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒(去內(nèi)毒素)購于EZNA公司，質(zhì)粒提取按說明書進(jìn)行，經(jīng)λDNA定量0.5 g/L者待用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取對數(shù)生長期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 h，0.25%胰酶消化后，含10%胎牛血清的IMEM培養(yǎng)基終止消化，收集備用。實驗分為空白組(M)，pSH1SiScramble組(N)，pSH1SiSTAT3組(T)，T組再按質(zhì)粒濃度分為T1、T2、T3。每組分24 h、48 h、72 h三個時間段，每時間段 4復(fù)孔。各組質(zhì)粒分別取：N組0.8 μg，T1組0.6 μg，T2組0.8 μg，T3組1.2 μg加染試劑2.0 μl，于24 h、48 h、72 h相差顯微鏡下觀察拍照后，各孔加入5 g/L的MTT 20 μl，孵育4 h，棄上清，每孔加入分析純DMSO 100 μl，震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A570)，計算細(xì)胞生長抑制率。實驗共重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 h，按上述方法收集細(xì)胞備用。實驗分為M、N、T共3組。將轉(zhuǎn)染試劑5.0 μl溶于終體積IMDM(17.7 g/L)100 μl，混勻后制成A液，室溫孵化10 min;各組質(zhì)粒分別取3.0 μg溶于IMDM(17.7 g/L)100 μl，混勻后制成B液;將A液加入B液，混勻后制成C液，室溫孵化10 min。分配C液200 μl到6孔板各孔中，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105/孔。轉(zhuǎn)染后72 h，相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-PCR 收獲的細(xì)胞按說明書完成RNA提取，取總RNA 10 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR條件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循環(huán)，25 μl體系，以βactin為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Gene genius凝膠成像系統(tǒng)分析后，以STAT3/βactin產(chǎn)物量的比值為最終結(jié)果。實驗重復(fù)3次。引物序列:STAT3：正向5′TTGCCAGTTGTGGTGATC3′，反向5′AGACCCAGAAGGAGAAGC3′;βactin:正向5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′，反向5′ATGCTATCACCTCCCCTGTG3′。

1.2.4 Western印跡法 收獲的細(xì)胞，加入裂解液，超聲裂解20 s，冰上靜置30 min，12 000 r/min 4℃離心25 min，上清為總蛋白粗提液。BCA法蛋白定量，取總蛋白40 μg/20 μl，煮沸變性5 min，SDSPAGE電泳后半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，AntiPSTAT3及βactin兔抗人多克隆抗體濃度為1∶1 000，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗?jié)舛葹?∶1 000，NBT/BCIP 顯色。Gene genius凝膠成像系統(tǒng)分析后，以STAT3/βactin蛋白量的比值為最終結(jié)果。實驗共重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞免疫組化法 按上述轉(zhuǎn)染步驟將細(xì)胞分M、N、T共3組轉(zhuǎn)染于6孔板內(nèi)，72 h后取出蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察拍照后用40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗3次，蒸餾水洗3次，TritonX 100(0.3%)洗10 min，PBS洗5 min×3次，其余步驟按免疫組織化學(xué)染色說明書操作。陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)或胞核棕黃著色，隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)陽性細(xì)胞占所研究細(xì)胞的15%以上即為陽性。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)(FCM) 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞1×106個，離心后用冷PBS懸浮，1 000 r/min離心10 min，清洗2遍，棄上清，將細(xì)胞用1 ml注射器快速推入700 ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上。PBS洗2次，調(diào)細(xì)胞密度為1×109/L，RNase消化后，加入50 mg/L 1.5 ml PI染液。混勻后上流式細(xì)胞儀做單參數(shù)分析，計算各期細(xì)胞所占比例，實驗共重復(fù)3次。

1.2.7 AO/EB雙染色 取轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞，制成懸液并調(diào)細(xì)胞密度為1×1010/L，取20 μl加100 mg AO染液2 μl及100 mg EB染液2 μl，滴于載玻片，蓋片封片后熒光顯微鏡直接觀察，于20 min內(nèi)計數(shù)500個細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，計量資料采用x±s表示;兩組均數(shù)的比較用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖活性判定 參照轉(zhuǎn)染試劑說明書推薦的質(zhì)粒最佳轉(zhuǎn)染濃度，設(shè)計3種不同濃度(0.015 g/L、0.020 g/L、0.030 g/L)的pSH1SiSTAT3，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活性隨質(zhì)粒濃度增高而下降，但在0.020 g/L和0.030 g/L濃度之間變化不大，故選擇0.020 g/L作為最佳質(zhì)粒濃度進(jìn)行以后的實驗。MTT結(jié)果顯示，N組細(xì)胞生長速度略慢于M組，T組細(xì)胞生長明顯慢于M組及N組，生長抑制率24、48、72 h分別為13.32%、35.44%、 44.14%，48 h及72 h組與M組細(xì)胞相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 HCT116細(xì)胞STAT3表達(dá) RTPCR結(jié)果顯示，T組STAT3基因的mRNA表達(dá)明顯降低，STAT3產(chǎn)物量/βactin的比值分別為0.866±0.03、0.853±0.02、0.453±0.03，T組與M組、N組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。Western印跡結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒治療組PSTAT3蛋白表達(dá)亦明顯減弱，STAT3蛋白量/βactin分別為0.780±0.01、0.713±0.01、0.430±0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示，M組及N組胞漿和/或胞核中可見大量棕黃著色細(xì)胞，而T組僅見部分細(xì)胞核中含有棕黃色顆粒。表1 不同處理組HCT116細(xì)胞吸光度A值比較圖1 不同處理組HCT116細(xì)胞STAT3基因mRNA表達(dá)

2.3 大腸癌HCT116細(xì)胞凋亡 FCM結(jié)果示T組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰，凋亡率達(dá)20.6%，與M組及N組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞周期分析示T組細(xì)胞出現(xiàn)G2期阻滯，T組S期與G2期細(xì)胞數(shù)與M組及N組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。AO/EB雙染色結(jié)果M組及N組細(xì)胞呈綠色或黃綠色熒光，T組細(xì)胞可見較多黃色熒光，偶見紅色熒光，提示實驗組細(xì)胞較多呈早中期凋亡。見圖3。圖2 不同處理組HCT116 STAT3蛋白Western印跡表2 不同處理組HCT116細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布圖3 不同處理組HCT116細(xì)胞AO/EB雙染色(熒光顯微鏡，×400)

3 討 論

STAT3是作為白細(xì)胞介素6(IL6)信號傳遞中的急性反應(yīng)因子最早被發(fā)現(xiàn)并被純化的〔3〕，其所參與的JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，為腫瘤形成過程中的重要環(huán)節(jié)〔2，4，5〕。Joshua等〔6〕研究表明，STATs所介導(dǎo)的JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。我們的前期研究亦證實在42例人大腸癌組織及癌旁組織中均有STAT3mRNA及蛋白的高表達(dá)，同時檢測的下游基因cmyc、survivin及VEGF基因在大腸癌及癌旁組織中的表達(dá)亦增高，p53基因降低，提示STAT3的異常激活在大腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的促進(jìn)作用并阻斷了某些重要抑癌基因的活性〔7〕，因而STAT3基因可望成為大腸癌治療的新靶點。

RNAi是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默方式〔8〕。并以其高效性、高特異性等優(yōu)點而作為研究基因功能的一種重要和常用的技術(shù)，已廣泛用于基因研究和臨床疾病尤其是腫瘤的治療研究，有廣闊的前景和應(yīng)用潛力。Zheng等用RNAi技術(shù)在人胰腺癌SW1990細(xì)胞中成功的抑制了STAT3的表達(dá)，為防止胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了新的策略〔9〕。本研究應(yīng)用針對人的STAT3基因的siRNA構(gòu)建表達(dá)載體pSilencer3.0U6STAT3siRNAGFP，轉(zhuǎn)染過度表達(dá)STAT3基因的人大腸癌細(xì)胞株HCT116，結(jié)果表明重組質(zhì)粒在mRNA及蛋白水平均可抑制STAT3基因表達(dá)，MTT結(jié)果亦表明T組HCT116細(xì)胞的增殖活性明顯減低，可見RNAi可使大腸癌HCT116細(xì)胞的生物學(xué)行為明顯受抑，為大腸癌的基因治療提供了可靠的依據(jù)。此外，應(yīng)用RNAi沉默STAT3基因后，S期細(xì)胞所占比例明顯減少而阻滯于G2期的細(xì)胞增加，凋亡細(xì)胞所占百分率明顯增加，這與Kunigal等〔5〕在乳腺癌中的研究相似。表明RNAi抑制STAT3基因可促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡，有助于抑制大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移并指導(dǎo)診療。我們在本研究中還發(fā)現(xiàn)N組的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)部分細(xì)胞形態(tài)改變， mRNA及蛋白表達(dá)也有變化，雖然與M組相比無顯著性差異，但提示轉(zhuǎn)染試劑及攜有無關(guān)序列的表達(dá)載體對細(xì)胞還是存在一定的毒性作用及脫靶效應(yīng)，如能有效克服，將使以siRNA為主的基因重組藥物發(fā)揮更理想的治療作用。

因此，應(yīng)用RNAi技術(shù)可抑制STAT3基因在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，人工合成的STAT3siRNAGFP可通過抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，STAT3基因可成為大腸癌治療中重要的靶點。