作者：蘇顯中 房婷 沈峰 戶登

【摘要】 目的 探討臨床分離鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)耐藥的分子機制。方法 以臨床分離的Ab 35、Ab 36染色體DNA為模板擴增abeM基因，對abeM基因擴增產物進行DNA測序及同源性分析；將abeM基因擴增產物與載體連接后轉化入大腸埃希菌KAM32感受態細胞中，對轉化子進行藥敏分析。結果 Ab 35和Ab 36的abeM基因擴增產物與已報道的abeM基因核苷酸序列同源性分別達99%和98%，Ab 35的abeM結構基因推導的氨基酸序列發生了3個氨基酸殘基變異，Ab 36的2個氨基酸殘基發生了變異；含有Ab 36的abeM基因的轉化子具有更廣和更強的耐藥圖譜；兩種轉化子的耐藥性均能被藥物外排泵抑制劑CCCP和維拉帕米逆轉。結論 鮑曼不動桿菌藥物外排蛋白AbeM中氨基酸殘基Val 52、Gln 203及Ser 256對多重耐藥強度具有重要作用，藥物外排泵抑制劑可有效抑制AbeM蛋白的耐藥活性。

【關鍵詞】 多重耐藥； 基因克隆； 鮑曼不動桿菌

ABSTRACT Objective To investigate the molecular mechanism of drugresistance in Acinetobacter baumannii (Ab) clinical isolates. Methods PCR amplification of drug resistance gene abeM was carried out using chromosomal DNA of Ab 35 and Ab 36 clinical isolates as template. PCR product of abeM gene was sequenced. The nucleotide sequences and deduced amino acid sequences were analyzed by BLAST of NCBI. After cells of Escherichia coli KAM32 transformed with a plasmid carrying the abeM gene PCR product， MICs of various drugs were determined by serial twofold dilution method. Results PCR product of Ab 35 or Ab 36 shared 99% and 98% identities with the gene abeM in Ab ATCC19606 which had been reported， respectively; three amino acid residues mutated in deduced amino acid sequences of abeM structure gene from Ab 35， two residues mutated in deduced amino acid sequences of abeM structure gene from Ab 36; the drug resistance was wider and stronger for the transformants carrying abeM gene of Ab 36; the drug resistance of two kinds of transformants could be reversed by CCCP and verapamil， two drug efflux pump inhibitors. Conclusion The amino acid residues Val 52， Gln 203 and Ser 256 of AbeM played the important roles in the intensity of multiple resistance; the drug efflux pump inhibitors CCCP and verapamil could effectively inhibited the drug resistance of AbeM.

KEY WORDS Multiple resistance; Gene cloning; Acinetobacter baumannii

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是一種好氧的非發酵類革蘭陰性桿菌。由于能夠引起諸如肺炎、泌尿器官感染、心內膜炎、傷口感染、腦膜炎及敗血病等，Ab已成為ICU的重要致病菌［1］。近年來Ab在世界范圍內逐漸呈現多重耐藥趨勢，2004年9月據我國臺灣地區報道一種超強細菌“泛耐藥性鮑曼不動桿菌”在臺灣多家醫院蔓延，其對處方藥物普遍存在抗性，患者的病死率高達60%［2］。我們在Ab ATCC19606的染色體DNA上已克隆出了abeM多藥外排基因，其編譯的多藥外排泵AbeM受質子電化學勢驅動，能夠將許多結構與功能不同的藥物主動排到細胞之外［3］。本文對兩株臨床分離鮑曼不動桿菌的abeM基因進行了克隆，并分析了多藥外排泵AbeM的氨基酸變異對其基質特異性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

臨床分離菌株Ab 35與Ab 36由應春妹副教授惠贈；藥物超感受性菌株Escherichia coli KAM32(主要藥物外排基因acrB、ydhE已被破壞)［3］以及質粒pUC19均為本實驗室保藏。細菌37℃有氧條件下培養在LB培養液中，其生長由測定650nm處光學密度進行監控。

1.2 藥敏分析

卡那霉素(kanamycin)、鏈霉素(streptomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、四環素(tetracycline)、紅霉素(erythromycin)、諾氟沙星(norfloxacin)、溴化乙錠(ethidium bromide)、羅丹明6G(rhodamine 6G)、脫氧膽酸鈉(dexoycholic acid salt，DC)、十二烷基硫酸鈉(dodecyl sodium sulfate，SDS)等各種藥物的最小抑制濃度(MIC)采用液體二倍稀釋法在含有不同藥物濃度的MHB培養基中進行測試［3］。細菌細胞在37℃培養24h后測試MIC值，每種藥物MIC值取細菌細胞不能生長的最低藥物濃度。在進行藥物外排泵抑制劑測試時，藥物外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)和維拉帕米(verapamil)的終濃度分別為1和100μg/ml。

1.3 分子操作

Ab 35和Ab 36的染色體DNA采用Chen等的方法［4］制備。根據已知藥物外排基因abeM的序列(注冊號AB204810)，利用軟件Oligo 6.0和Primer 3設計引物，其引物序列為：5′GTGAATTCGGGCAATTGGTCATTTCTATGT3′，5′TCGAATTCGAAAGAGCATCAGTTCAATGTGG3′。95℃變性5min后，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 2min，30個循環，72℃延伸5min。PCR儀為美國MJ Research公司，PTC100，引物合成和PCR反應試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)公司。

PCR產物用PCR產物回收試劑盒(DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，TaKaRa)回收，其與質粒pUC19分別經EcoR I酶切，連接后轉化到E.coli KAM32感受態細胞中，重組質粒分別命名為pABS35和pABS36。

1.4 擴增產物的序列測定及同源性分析

將PCR產物純化后送大連寶生物工程有限公司進行DNA測序，測序結果在GenBank上用BLAST進行同源性檢索分析。

2 結果

2.1 PCR擴增檢測abeM藥物外排基因

以Ab 35和Ab 36染色體DNA為模板，用設計的基因引物進行PCR擴增，均獲得一條約1.84kb的陽性擴增條帶(圖1)。將產物與經過處理的載體pUC19分別連接后獲得重組質粒pABS35和pABS36。

2.2 擴增產物的DNA序列分析

將重組質粒pABS35和pABS36測序，獲得的abeM基因序列分別在GenBank中進行BLAST檢索，發現它們與Ab ATCC19606 abeM基因的核苷酸序列高度同源。來源于Ab 35 abeM結構基因的核苷酸序列與Ab ATCC19606的有99%同源性，推導的氨基酸序列發生了3個氨基酸殘基的變異，Val 52→Glu，Gln 203→Lys，Ser 256→Gly；來源Ab 36 abeM結構基因的核苷酸序列與Ab ATCC19606的有98%的同源性，2個氨基酸殘基發生了變異，Ser 233→Asn，Lys 308→Glu。啟動子序列沒有發生任何變化。

2.3 重組子的藥敏分析

將重組質粒pABS35和pABS36分別轉化入E.coli KAM32感受態細胞中，其藥物MIC值見表1。

M：核酸分子量標準品

1：Ab 35中的擴增產物； 2：Ab 36中的擴增產物

圖1abeM基因的PCR擴增產物電泳圖譜 表1 轉化子對各種藥物的敏感性含有pABS35的E.coli KAM32對鏈霉素、溴化乙錠、羅丹明6G及脫氧膽酸鈉耐藥(相對耐藥性大于或等于4倍)，含有pABS36的E.coli KAM32對鏈霉素、諾氟沙星、溴化乙錠、羅丹明6G、脫氧膽酸鈉及十二烷基硫酸鈉具有很明顯的抗性。總之，含有pABS36的E.coli KAM32比含有pABS35的E.coli KAM32具有更廣和更強的藥物抗性圖譜。

2.4 藥物外排泵抑制劑對重組子耐藥性的影響

加入藥物外排泵抑制劑CCCP和維拉帕米，調查它們對轉化子有抗性藥物的MIC值的影響。經測試發現，含有pABS35的E.coli KAM32對鏈霉素與溴化乙錠的耐藥性在抑制劑作用下得到了控制(MIC降至原值的1/4)；含有pABS36的E.coli KAM32的耐藥性，除了對十二烷基硫酸鈉的耐藥性沒有得到抑制外，其余藥物的MIC值都降至原值的1/4以下，并且CCCP的作用強于維拉帕米(表2)。

3 討論

關于鮑曼不動桿菌的耐藥機制研究，目前發現使藥物降解或因gyrA和parC基因突變以及藥物的修飾與酶學失活都可以導致藥物抗性［5，6］，細菌外膜蛋白表2 加入外排泵抑制劑的轉化子對各種藥物的敏感性(OMPs)表達減少也被證明是與有些藥物抗性相關的［7］，多藥外排泵介導多重耐性也已見報道［3，8，9］，再加上其可以形成生物被膜［10］，如此多種耐藥機制使得鮑曼不動桿菌耐藥問題日漸復雜，臨床分離出的多重耐藥菌株日漸增多，為臨床治療帶來了新的難題。

AbeM是一個組成性、質子介導的MATE家族多藥外排泵，在鮑曼不動桿菌多重耐藥中發揮著重要作用［3］。通過對基因abeM進行克隆及測序分析，結合表1的結果發現，盡管Ab 36相對Ab 35的abeM結構基因核苷酸出現更多的變異，但因多為同義突變，推導的氨基酸序列中Ser233→Asn與Lys 308→Glu的變異對AbeM的藥物外排作用并沒有產生明顯的影響(與來自Ab ATCC19606的AbeM基質特異性比較，數據未列出)；從Ab 35的abeM結構基因核苷酸序列推導出的氨基酸序列中，Val 52→Glu，Gln 203→Lys，Ser 256→Gly的變異明顯降低了AbeM對諾氟沙星與溴化乙錠的外排作用，說明Val 52、Gln 203與Ser 256可能是以某種組合方式參與了上述兩種藥物的外排；另外，這3個氨基酸殘基的變異在具有不同基質特異性的Ab 35和Ab 36(數據未列出)當中是否發揮著作用也有待進一步的研究。

CCCP與維拉帕米均為藥物外排泵的抑制劑，可直接或間接去除細胞膜質子電化學勢而阻遏外排泵對藥物的外排。表2結果表明這兩種抑制劑可明顯降低AbeM對藥物的外排作用(十二烷基硫酸鈉除外)，即可以增強藥物在胞內的蓄積，實現藥物殺菌的效果，這與我們以前研究Ab ATCC19606的結果一致。由于測試時使用的抑制劑濃度對人體可能會產生負面影響，從中藥材或其它天然物質中提取、篩選對人體無毒無害的高效外排泵抑制劑將是治療該菌引起感染的一個可行的方向。