【摘要】 目的 探討胃癌細(xì)胞株MGC803對(duì)順鉑（CDDP）耐藥產(chǎn)生的有關(guān)機(jī)制。方法 觀察不同濃度CDDP(0.1、1.0、10.0mg/L)對(duì)MGC803細(xì)胞增殖、凋亡及抗凋亡基因survivin，bcl2 mRNA表達(dá)的影響，用MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率；熒光染色檢測細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期的變化；RTPCR檢測survivin、bcl2 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 10mg/L的CDDP對(duì)MGC803細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用，而0.1、1.0mg/L的CDDP干預(yù)24h后，其抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用逐漸消失；CDDP作用于細(xì)胞48h后，細(xì)胞S期增加，G2/M期下降；MGC803細(xì)胞在1.0mg/L的CDDP作用下，survivin mRNA表達(dá)自24h后逐漸增高，bcl2 mRNA表達(dá)逐漸下降(P＜0.05)。結(jié)論 CDDP可干擾MGC803細(xì)胞周期，但該細(xì)胞對(duì)低濃度CDDP易于產(chǎn)生耐藥，survivin mRNA表達(dá)增高可能是MGC803細(xì)胞對(duì)CDDP產(chǎn)生耐藥原因之一。

【關(guān)鍵詞】 胃癌細(xì)胞株 順鉑 耐藥 細(xì)胞凋亡 survivin bcl2

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，其死亡率居各類惡性腫瘤之首，化療作為胃癌的重要治療手段之一，其療效仍不令人滿意，原因主要與癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。為此，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[1]， 將胃癌常用化療藥物順鉑（Cisplatin，CDDP）設(shè)為三個(gè)不同作用濃度，通過檢測MGC803細(xì)胞在順鉑作用過程中細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)基因survivin、bcl2 mRNA的表達(dá)變化，探討胃癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物順鉑耐藥的產(chǎn)生及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液，Trizol（GibcoBRL公司）；小牛血清（杭州四季青公司），四噻唑藍(lán)（MTT）、溴已定（EB）、丫啶橙（AO）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司），survivin、bcl2引物[2](上海生工合成)；βactin（上海瑞科公司）；二步法RTPCR試劑：Taq酶、oligodT、dNTP、DEPC（Sangon公司），MNLV、Rnasin（Promeg公司），CDDP（山東齊魯制藥廠，生理鹽水溶解，培養(yǎng)液稀釋）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

人胃低分化腺癌細(xì)胞株MGC803購自湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞于含青霉素100U/L，鏈霉素100mg/L，10％滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色法測定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以5×103/孔接種MGC803細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組加CDDP處理，使終濃度分別達(dá)0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L，對(duì)照組加生理鹽水，共同孵育12、24、48、72h，加20μl的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加150μl的DMSO，酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定570nm處的吸光值A(chǔ)570nm，并計(jì)算該濃度下的抑制率＝[(對(duì)照組A570nm -試驗(yàn)組A570nm)／對(duì)照組A570nm]×100％。

1.2.3 熒光顯微鏡檢測各組藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的作用

MGC803細(xì)胞加CDDP處理，使終濃度分別達(dá)0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，作用12、24、48、72h，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，收集細(xì)胞離心，棄上清，PBS洗3次，制成細(xì)胞懸液，加入終濃度均為100μg/ml的AO、EB，混勻，于顯微鏡下計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞的凋亡比率。早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，呈固縮狀或圓珠狀；晚期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著桔紅色，呈固縮狀或破裂狀；壞死細(xì)胞核染色質(zhì)著桔紅色，呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)；活細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測各組藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響

MGC803細(xì)胞加CDDP處理，使終濃度達(dá)0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，對(duì)照組加生理鹽水，共同作用48h，常規(guī)消化細(xì)胞，離心，PBS洗2次，每管加入70％的冰乙醇1～1.5ml，使每個(gè)樣品含細(xì)胞數(shù)至少1×106個(gè)，－20℃固定送檢流式細(xì)胞。

1.2.5 RTPCR法檢測CDDP干預(yù)前后survivin、bcl2 mRNA表達(dá)變化

總RNA的制備：MGC803細(xì)胞接種于6孔板，試驗(yàn)組加CDDP處理，使終濃度達(dá)1.0mg/L，對(duì)照組加生理鹽水，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用Trizol法提取藥物干預(yù)前及干預(yù)12、24、48、72h細(xì)胞總RNA。

RNA逆轉(zhuǎn)錄：按MMLV說明書進(jìn)行，cDNA置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系包括10×Taq Buffer5μl，25mM/L MgCl23μl，10mM DNTP1μl，10pmol/μl的目的基因上、下游引物(survivin上游引物: 5'CAG ATT TGA ATC GCG GGA CCC 3'， 下游引物: 5'CCA AGT CTG GCT CGT TCT CAG 3'; bcl2上游引物: 5'GTG GAG GAG CTC TTC AGG GA 3'， 下游引物: 5' AGG CAC CCA GGG TGA TGC AA 3')、βactin上、下游引物各2μl，cDNA模板4μl，2.5U/μl Taq酶1μl，補(bǔ)充DEPC水至50μl。置PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，95℃預(yù)變性5min，變性、退火、延伸分別為94℃30s、X℃（survivin為61℃、bcl2為59℃）1min 、72℃1min，30個(gè)循環(huán)后72℃終末延伸10min。PCR產(chǎn)物用含0.5mg/Lde1的EB瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀分析結(jié)果，計(jì)算目的基因與相應(yīng)βactin的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

定量及半定量資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， SKNq檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測定各濃度CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

各復(fù)孔平均吸光值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度CDDP（10.0mg/L）組隨時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖降低明顯(P＜0.05)；而低濃度(0.1mg/L、1.0mg/L)CDDP組在作用24h后不再明顯下降，說明MGC803細(xì)胞對(duì)低濃度CDDP抑制增殖作用易產(chǎn)生耐受，見表1。表1 CDDP 對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)組與CDDP處理前比較，*P<0.05，**P<0.012.2熒光染色檢測各組CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

熒光染色計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高濃度的CDDP（10.0mg/L）作用后，細(xì)胞凋亡率隨作用時(shí)間的延長而增加(P＜0.05)，見圖1，而低濃度的CDDP（0.1mg/L，1.0mg/L）作用于MGC803細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率幾乎不再發(fā)生改變，表2。表2CDDP對(duì) MGC803細(xì)胞凋亡的影響表達(dá)變化（bcl2 mRNA 304bp，βactin 500bp）

2.3流式細(xì)胞檢測各組CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

MGC803細(xì)胞經(jīng)不同濃度的CDDP作用48h后，細(xì)胞S期比率逐漸增加，G2/M期下降。CDDP對(duì)細(xì)胞周期的影響具有明顯的量效依賴關(guān)系，見表3。表3 CDDP對(duì) MGC803 細(xì)胞周期的影響

2.4RTPCR檢測CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞survivin、bcl2 mRNA表達(dá)的影響

RTPCR檢測survivin、bcl2 mRNA表達(dá)的變化(圖2、3)、凝膠成像分析儀分析結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，MGC803細(xì)胞在低濃度（1.0mg/L）CDDP作用下，survivin mRNA在24、48、72h后表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，72h后其表達(dá)接近于對(duì)照組的3倍。而 bcl2 mRNA在干預(yù)12、24、84、72h表達(dá)逐漸減弱。表4 半定量RTPCR檢測CDDP 對(duì) MGC803細(xì)胞

3討論

臨床上由于大劑量化療藥物毒副作用大，患者不能耐受，小劑量極易產(chǎn)生耐藥等原因，極大地影響了其療效。積極探索腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥機(jī)制，克服腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生，是胃癌非手術(shù)治療急需解決的問題之一。

survivin廣泛表達(dá)于機(jī)體胚胎及惡性腫瘤組織 [4，5]，它在胃癌病理組織中表達(dá)高達(dá)82%[6]，而在正常組織、終末分化組織中表達(dá)陰性，同時(shí)survivin表達(dá)情況與腫瘤組織的轉(zhuǎn)移、浸潤及化學(xué)耐藥等惡性生物學(xué)行為密切有關(guān)[7]，其作用機(jī)制與IAP家族的其他蛋白相似，它通過抑制caspase3和7酶原的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡，此外，survivin還參與了細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用survivin反意寡核苷酸抑制正常和腫瘤細(xì)胞survivin的表達(dá)，結(jié)果在細(xì)胞凋亡增加的同時(shí)，多倍體產(chǎn)生增多，軟瓊脂培養(yǎng)基中的集落減少[8]，轉(zhuǎn)染survivin基因的293細(xì)胞增殖速度加快[9]，表達(dá)磷酸化缺陷survivin突變體可以增加人類黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[10]。bcl2是較早發(fā)現(xiàn)的、重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，在多種惡性腫瘤組織過度表達(dá)，它通過阻止鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞漿釋放，使依賴鈣離子的核酸內(nèi)切酶活性降低，抑制氧化自由基的產(chǎn)生等阻斷細(xì)胞凋亡，增加腫瘤播散侵襲能力。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MGC803細(xì)胞存在凋亡抑制基因survivin和bcl2 mRNA的表達(dá)。

CDDP可使腫瘤細(xì)胞周期發(fā)生改變，從而誘導(dǎo)周期特異性細(xì)胞凋亡[11，12]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，MGC803細(xì)胞經(jīng)CDDP處理后，細(xì)胞S期比例增加，G2/M期下降，說明細(xì)胞受阻于S期，不能進(jìn)入G2/M期，這與有關(guān)對(duì)食管癌的研究報(bào)道相一致[13]。然而其臨床療效卻不十分樂觀，主要原因與腫瘤細(xì)胞的耐藥有關(guān)，結(jié)果表明，大劑量CDDP（10.0mg/L）可抑制胃癌細(xì)胞株MGC803增殖、誘導(dǎo)凋亡，并具有較好的時(shí)效相關(guān)性，但該濃度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于臨床用藥劑量，臨床最大用藥劑量的血藥峰值濃度為2mg/L[14]，而接近這一濃度的低濃度組（0.1mg/L，1.0mg/L）對(duì)此胃癌細(xì)胞系作用較弱，藥物干預(yù)24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率幾乎不再發(fā)生改變，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用也逐漸減弱，表明MGC803細(xì)胞對(duì)低濃度CDDP極易產(chǎn)生耐藥，其機(jī)制目前尚不十分清楚。除了腫瘤細(xì)胞能過度表達(dá)mdrl編碼的P糖蛋白，增加藥物排出外，還在于腫瘤細(xì)胞能抵抗藥物誘導(dǎo)的凋亡。有研究認(rèn)為，化療藥物接觸腫瘤細(xì)胞后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞COX2表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)抗凋亡基因bcl2的表達(dá)[15]，此外，新近研究還發(fā)現(xiàn)，CDDP可誘導(dǎo)凋亡抑制基因家族（IAP）的新成員survivin的表達(dá)增加[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，MGC803細(xì)胞經(jīng)低濃度（1mg/L）CDDP作用后，survivin mRNA于干預(yù)后24、48、72h表達(dá)逐漸增強(qiáng)，72h接近于對(duì)照組的3倍，Ikeguchi等報(bào)道了用小劑量CDDP（0.1mg/L， 1mg/L）作用于胃癌細(xì)胞系MKN45后，早期（1h）細(xì)胞凋亡明顯增加，干預(yù)后期（48h）凋亡細(xì)胞百分比不再發(fā)生變化，細(xì)胞survivin mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加，其報(bào)道與本研究結(jié)果相一致。CDDP誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制與Caspases3的活化有關(guān)，而survivin則是通過抑制Caspases3的活化而抑制細(xì)胞凋亡的，由此認(rèn)為survivin的表達(dá)增加可抵抗CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生耐藥[1618]，bcl2 mRNA表達(dá)在CDDP干預(yù)后，逐漸下降，表明其表達(dá)受到CDDP的抑制，這一結(jié)果與部分文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不一致，其原因可能與使用的腫瘤細(xì)胞不同有關(guān)，文獻(xiàn)認(rèn)為bcl2表達(dá)增高是由于腫瘤細(xì)胞在CDDP作用下經(jīng)COX2受體介導(dǎo)所致，而胃癌MGC803細(xì)胞株COX2蛋白表達(dá)陰性。

結(jié)果證實(shí)低濃度CDDP可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株MGC803 survivin mRNA表達(dá)增強(qiáng)，這一凋亡相關(guān)基因的改變，可能是導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的原因之一，而在這一過程中bcl2的作用似乎不明顯。