作者：王麗萍王寶中司海運趙春亭隋振霞

【摘要】 ［目的］ 研究透明質酸寡糖逆轉MCF?7/ADM細胞耐藥的作用。［方法］ MTT法研究透明質酸寡糖對MCF?7/ADM耐藥逆轉作用，流式細胞術測定細胞表面耐藥相關蛋白P?gp、MRP的表達及凋亡調控蛋白p53、bcl?2的表達。［結果］ 透明質酸寡糖可提高MCF?7/ADM對化療藥的敏感性，使P?gp、MRP表達下降，p53表達增高。［結論］透明質酸寡糖可部分逆轉MCF?7/ADM耐藥及促進凋亡的作用。

【關鍵詞】 透明質酸寡糖MCF?7/ADM逆轉耐藥凋亡

腫瘤細胞對化療藥物產生多藥耐藥性是腫瘤治療失敗的重要原因，克服多藥耐藥性的方法之一是使用逆轉劑[1，2]。目前雖已找到許多逆轉多藥耐藥的藥物，但是，或由于效果不夠滿意，或其毒副作用較大，很難在臨床推廣。本實驗利用人乳腺癌耐阿霉素細胞系，以MTT法、流式細胞術，研究透明質酸寡糖（hyaluronate oligomers，oligo?HA）對耐藥細胞的增敏及耐藥逆轉作用，并從降低膜表面轉運蛋白表達，促進耐藥細胞凋亡的角度探討其逆轉耐藥的機制，以期能尋找到逆轉MDR作用強、毒性小的藥物。

1 材料與方法

1.1 材 料

乳腺癌MCF?7/S敏感細胞及對阿霉素耐藥MCF?7/ADM細胞，源于中國醫學科學院天津血液病研究所。細胞培養于IMDM培養液中，含10％胎牛血清，試驗用對數生長期細胞。PE?P?gp單抗、PE?MRP單抗、FITC?bcl?2單抗、FITC?p53單抗，均為美國Biosciences Pharmingen產品；oligo?HA（M.W.2500Da）和MTT分別為Seikagaku公司、Sigma公司產品。 EL340i型酶聯免疫儀，美國Biotok公司；FACSCaliber型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養及實驗分組

取對數生長期的MCF?7／ADM細胞系，均隨機分為實驗孔和對照孔，各組實驗孔和對照孔分別設6個復孔，每組實驗重復3次。其中實驗孔加入不同濃度（50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml）的透明質酸寡糖（以下均用HA1、HA2和HA3表示）。對照組不加任何試劑或加等體積的培養液。各實驗孔細胞均與oligo?HA共培養48h后，收集并進行以下各試驗。

1.2.2 oligo?HA對MCF?7／ADM的耐藥逆轉作用

將上述經oligo?HA作用后的實驗組細胞和對照組細胞收集后，以5×104接種于96孔板中，每孔190μl 37℃ 5% CO2、飽和濕度的條件下培養24h，然后加入不同濃度梯度的抗癌藥物（另設空白對照孔及調零孔，每濃度設6個復孔）。在培養箱里讓細胞與藥物作用48h。每孔加入10μ1的MTT，繼續培養3h，棄上清，每孔加入DMSO100μl，振蕩使甲瞻晶體充分溶解后，用酶標儀(波長490nm)檢測OD值；然后計算各組的細胞存活率、死亡率及耐藥逆轉倍數。

細胞存活率=實驗組OD／對照組OD×100％

細胞死亡率=(1-實驗組OD／對照組OD)×100％

耐藥逆轉倍數=逆轉劑加抗癌藥物組細胞死亡率／抗癌藥物組細胞死亡率

1.2.3 oligo?HA對細胞內藥物積累分析

分別向上述實驗孔和對照孔細胞中加入終濃度為10μg／ml的阿霉素。在原細胞培養條件下，繼續培養3 h，經流式細胞儀檢測細胞內ADM的相對熒光強度。

1.2.4 膜表面耐藥相關蛋白P?gp表達測定

收集上述培養的各組實驗孔和對照孔細胞并調節濃度為1×106／ml，加入PE標記的P?gp抗體20μl，37℃避光胞膜染色30min，流式細胞儀檢測平均熒光強度。

1.2.5 凋亡調控蛋白bcl?2、p53表達測定

細胞培養及實驗分組同上，分別加入FITC標記的bcl?2及p53抗體20μl，流式細胞儀檢測平均熒光強度。

1.2.6 統計方法

采用SPSSl0．0軟件包進行統計學處理。數據用均數±標準差(x±s)表示，計量資料用配對t檢驗，以P<0．05作為顯著界限。

2 結 果

2.1 oligo?HA增強耐藥細胞對阿霉素的敏感性

不同濃度oligo?HA均能明顯增加耐藥細胞MCF?7/ADM對ADM的敏感性，增加耐藥細胞死亡率，與對照組比較差異有顯著性(P<0．05)，增敏倍數分別為1.48、2.04、1.89;另外，MCF?7/ADM與MCF?7/S 組間各細胞死亡率比較，差異亦均具統計學意義(P<0．05) (見表1)。

2.2 oligo?HA增加胞內ADM蓄積

流式細胞儀檢測104個耐藥細胞內ADM的相對熒光強度，HA1+ADM、HA2+ADM、HA3+ADM組熒光值分別為15.78±1．19、19.34±0．65和19.57±1．61；相同培養基的MCF?7/ADM中直接加ADM組（對照組）熒光值為12．68±0．54。結果表明，三組均能明顯增加ADM在細胞內含量，使ADM胞內積累增加1．21、1.44和1．43倍，與對照組比較有顯著性意義(P<0．05)；另外， HA2 、HA3劑量組間未顯示有明顯的差異(P>0．05)；HA1 與另兩組比較差異有統計學意義(P<0．05)。

2.3 oligo?HA對耐藥相關蛋白及凋亡調控蛋白的作用

見表2。與對照組細胞比較，各濃度oligo?HA均能明顯降低膜表面P?gp、MRP表達(P值均<0．05)，其中，HA2與HA3組間未顯示有明顯的差異(P>0．05)。另外，HA2、HA3濃度組均可上調凋亡調控蛋白p53表達(P值均<0．05)；且各組均對bcl?2表達無明顯作用(P>0．05)，說明各濃度oligo?HA均有一定程度降低膜表面耐藥蛋白表達及促耐藥細胞凋亡的作用。

3 討 論

目前研究已證實，P?gp高表達是腫瘤細胞多藥耐藥的發生機制之一，P?gp是一種能量依賴性藥物排出泵，通過ATP供應能量，可將抗腫瘤藥物由細胞內泵出，使其細胞毒作用減弱或消失，而導致化療失敗。最近，研究人員發現先前被認為在細胞中起到結構性和惰性作用的透明質酸，事實上是引發癌細胞抗藥反應的關鍵物質，透明質酸能和其受體蛋白CD44結合，與磷酸肌醇?3激酶一起，促使癌細胞增加生成，能把藥物運輸出細胞的蛋白質如P?gp，從而使癌細胞產生抗藥性[3，4]。癌細胞中透明質酸的量越多，抗藥性就越強。因此如果能夠阻斷這一環節，可能增敏化療藥物抗性的癌細胞對化療藥物的敏感性。多糖低聚物或單抗能與透明質酸的一個受體CD44結合并阻止它啟動一種可能導致藥物抗性的信號級聯，從而逆轉耐藥。

另有文獻報道，腫瘤細胞多藥耐藥的發生機制涉及腫瘤抑制蛋白p53的失活，誘導耐藥細胞的凋亡可能對改善耐藥細胞的對藥性有一定作用[5，6]。bcl?2和p53均為凋亡調控蛋白，bcl?2抑制腫瘤細胞凋亡，p53促進腫瘤細胞凋亡。因此， p53表達上調或bcl?2下調，均能促進腫瘤細胞凋亡而達到一定程度逆轉耐藥的作用。本實驗從阻斷信號傳導和促進凋亡兩方面來研究oligo?HA對耐藥細胞系逆轉耐藥的作用，為臨床應用提供理論基礎。

我們的研究表明透明質酸寡糖的干預能增強化療藥ADM對MCF?7/ADM的敏感性，使ADM對耐藥細胞的殺傷性增大，并可增加胞內化療藥物濃度，以逆轉MCF?7/ADM細胞的耐藥性。同時發現隨著透明質酸寡糖濃度(50μg/ml～150μg/ml)的增大，耐藥腫瘤細胞死亡率逐漸增高，且胞內阿霉素的濃度亦增多，逆轉能力逐漸增強。另外，我們發現經過處理后的耐藥細胞，耐藥蛋白P?gp、MRP的表達率明顯降低；透明質酸寡糖濃度在50μg/ml時p53的表達無明顯上調，但隨濃度的提高，p53表達明顯上調。從而提示透明質酸寡糖可能通過抑制MDR蛋白的表達、調控凋亡蛋白來逆轉細胞對ADM的耐藥，且上調凋亡蛋白的透明質酸寡糖濃度應大于50μg/ml。

綜上所述，臨床應用透明質酸拮抗劑如小分子的透明質酸寡糖能夠逆轉癌細胞藥物抗性。我們可以設想將這種透明質酸拮抗劑與化療相結合，可能會達到更好的治療效果。