作者：趙菲，姜軍，范林軍，楊新華，張毅

【關鍵詞】 基因

Pglycoprotein expression in the development of primary multidrug resistance in breast carcinoma

【Abstract】 AIM: To study the expression and significance of Pglycoprotein (Pgp) in the development of multidrug resistance in breast cancer. METHODS: The expression of Pgp and MDR1 mRNA were detected by immunohistochemistry and reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) in the specimens from 25 breast cancer patients with neoadjuvant chemotherapy (NAC group)， 15 breast cancer patients without neoadjuvant chemotherapy (nonNAC group) and 10 patients with breast adenosis (control group). RESULTS: The positive rate of Pgp expression was 84.0%（21/25）， 46.7%（7/15）and 0 in NAC group， nonNAC group and control group， respectively. MDR1 mRNA expression was 84.0%（21/25）， 53.3%（8/15）and 10%（1/10） in three groups respectively. Significant difference was found between the three groups (P<0.01). CONCLUSION: Some tumor cells tolerances to chemotherapeutics increase during the process of oncogenesis and the tolerances can be induced by an extremely low expression of MDR1/Pgp. MDR1/Pgp is associated with the intrinsic multidrug resistance in breast carcinoma.

【Keywords】 Pglycoprotein; genes， MDR; breast neoplasms

【摘要】目的：研究乳腺癌原發性耐藥過程中P糖蛋白（Pglycoprotein， Pgp）的表達特征，初步探討乳腺癌原發性耐藥的發生機制. 方法： 采用免疫組織化學及逆轉錄多聚酶鏈反應技術，對25例接受術前新輔助化療的乳腺癌患者、15例未接受術前化療的乳腺癌患者、10例乳腺腺病患者組織標本內Pgp 和MDR1 mRNA的表達情況進行檢測. 結果： Pgp表達陽性率在乳腺癌術前化療組患者和未化療組患者中分別為84.0%（21/25）和46.7%（7/15），對照組未見Pgp表達； MDR1表達陽性率在三組則分別為84.0%（21/25）、53.3%（8/15）和10%（1/10），組間差異均顯著（P＜0.01）. 結論：部分乳腺癌細胞在惡性變的過程中同時伴有對化療藥物耐受能力的增加，腫瘤細胞內極低水平的MDR1 mRNA表達即可導致多藥耐藥，MDR1/Pgp與乳腺癌的內源性耐藥相關.

【關鍵詞】P糖蛋白；基因，MDR；乳腺腫瘤

0引言

多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）是腫瘤治療失敗的重要原因. 目前對MDR的研究主要集中于腫瘤細胞在化療藥物誘導下所產生的獲得性耐藥，對內源性耐藥機制的研究則尚欠深入. 而在臨床治療中，若預先了解腫瘤細胞的內源性耐藥狀況，不僅可以避免因使用MDR型藥物而導致的獲得性多藥耐藥，而且可以針對腫瘤的耐藥特點使用逆轉劑，提高化療效果. 我們通過免疫組化方法及RTPCR法檢測P糖蛋白（Pglycoprotein， Pgp）及其編碼基因MDR1（multidrug resistance 1）在乳腺癌原發性耐藥過程中的表達.

1材料和方法

1.1材料

200302/200310住院女性乳腺癌患者接受術前化療者25例（術前化療組），未行術前化療者15例（術前未化療組），乳腺腺病手術患者10例（對照組）. 3組患者年齡無顯著差異，組間均衡性好. 取材后標本直接置于液氮中凍存備用. 采用福州邁新生物技術開發公司的免疫組化染色試劑盒與即用型抗Pgp mAb.

1.2方法

按說明書進行. Pgp以胞質和胞膜呈棕黃色著色為陽性，染色強度與陽性細胞的百分比乘積>3分為免疫反應（+）. 采用Roche公司的Tripure試劑提取組織總RNA. 獲得的RNA行瓊脂糖凝膠電泳見清晰的28 S， 18 S rRNA條帶；紫外分光光度儀測定其260 nm及280 nm的A值比值>1.65，證實樣本無污染. RNA濃度=A260×37×500 mg/L. RTPCR采用兩步法，逆轉錄反應體系： 5×緩沖液5.0 μL， 10 mmol/L dNTP 1.25 μL， 40 MU/L Rnasin 0.625 μL， 200 MU/L MMlV逆轉錄酶1.0 μL，加DEPC去離子水至總體積25 μL，PCR儀上42℃逆轉錄60 min， 99℃ 5 min滅活逆轉錄酶；PCR反應體系： 逆轉錄產物10 μL，10×緩沖液5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 8 μL， 2.5 mmol/L dNTP 4 μL， 5 MU/L Taq酶0.25 μL， 20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，并設βactin為內參，加DEPC去離子水至總體積50 μL. 引物序列如下： MDR1： 上游5′GTTGCCATTGACTGAAAGAAC3′，下游5′ ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA3′；βactin：上游5′CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3′，下游5′AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGA3′. 反應條件：開始94℃ 5 min充分變性，而后變性94℃ 45 s，退火59℃ 50 s，延伸72℃ 90 s，30個循環，最后72℃延伸10 min. 取PCR產物10 μL，加入含溴酚藍的上樣緩沖液1 μL，于1.5 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下照相并保存. 凝膠照相后，于Gel Doc 2000凝膠圖像分析系統進行掃描，用Quantity one Version 4.0軟件分析. 測定產物條帶的積分吸光度（integral absorbance， IA）后計算相對吸光度（relative absorbance， RA），RA＝IA目的片段/IAβactin，代表各產物的相對含量，即各目的片段mRNA在組織內穩態水平的高低.

統計學分析： 采用SPSS11.0軟件進行. 本資料為偏態分布，率的比較采用Fisher精確檢驗，3組間RA的比較采用非參數秩和檢驗（KruskalWallis檢驗），P<0.05為有統計學意義.

2結果

Pgp的表達率，在化療組、非化療組和對照3組間差異顯著（84.0%， 46.7%， 0.0%， P<0.01， Fig 1~3）. RA及MDR1基因擴增率，3組間差異顯著（Tab 1， P<0.01， Fig 4~6）.表1乳腺癌組織MDR1mRNA表達（略）

3討論

P糖蛋白是第一個被發現與腫瘤MDR相關的ATP結合盒超家族成員，其在正常乳腺組織中不表達，在乳腺癌組織中則表達水平升高，且Pgp的過度表達并非腫瘤細胞的特性，而是在腫瘤組織和瘤周正常組織中均可見的普遍現象. 腫瘤細胞中Pgp的表達可使細胞在MDR型藥物誘導下產生多藥耐藥性，因此，其表達水平也可能成為臨床化療中一個有用的預測指標［1， 2］.

本研究采用免疫組化及RTPCR方法，進行蛋白的定位和基因的半定量檢測. 在乳腺癌患者術前化療組中，Pgp蛋白與MDR1基因的表達率均為84.0% （21/25），與多數文獻報道結果相符［3，4］； 在未接受術前化療的乳腺癌患者中，二者的表達率則分別為46.7%（7/15）和53.3%（8/15），基因擴增水平高于蛋白表達，二者雖然高度相關，但并不完全相符，其中，有4例患者有MDR1基因擴增而無Pgp蛋白的表達，3例患者有蛋白的表達而無基因擴增；在10例對照組標本中，1例可見極弱的MDR1基因條帶，而Pgp蛋白的表達則為陰性. 因此，MDR1基因的擴增并非總是能夠導致蛋白產物的過度表達，而蛋白產物的過度表達亦并非一定由基因擴增引起. 對于人類乳腺癌MDR細胞系的研究表明，MDR1基因的表達調控可發生在DNA， RNA和蛋白質等各級水平，如細胞中Ybox轉錄調節因子YB1的過度表達及核定位與MDR1表達上調有關［5］；ras基因［6］和突變型p53［7］可激活MDR1基因轉錄，使Pgp表達增高；Pgp蛋白在翻譯后水平的糖基化［8］和磷酸化［9，10］修飾則對維持其功能十分重要. 對MDR1基因的RTPCR半定量檢測結果顯示，術前化療組、未化療組及對照組患者中MDR1的平均相對密度分別為0.63， 0.22和0.03，兩兩比較差異顯著（P<0.01）. 上述結果支持化療可誘導MDR1/Pgp表達的觀點，與既往研究結果一致；而未化療組與對照組的研究結果則顯示，部分乳腺癌患者在接觸化療藥物之前即出現MDR1/Pgp的表達增高，說明乳腺組織細胞在惡性變的過程中同時伴有對化療藥物耐受能力的增加，MDR1/Pgp與乳腺癌的內源性耐藥相關. 以往研究證實，腫瘤細胞內極低水平的MDR1 mRNA表達即可導致多藥耐藥［11，12］；MDR的遺傳學基礎［13］業已證明，腫瘤細胞在增殖過程中有較為固定的突變頻率，每次突變均可導致耐藥性瘤株的出現. 但是，腫瘤細胞的突變是如何發生的、MDR1基因在突變過程中的作用及其機制等問題仍需進一步的研究.

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