【摘要】 目的 了解青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌耐吡嗪酰胺（PZA）分離株pncA基因突變的情況，探討其與耐PZA之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)對76例結(jié)核分支桿菌臨床分離株進行結(jié)核分支桿菌常規(guī)培養(yǎng)和藥敏檢測，聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCRSSCP）技術(shù)檢測pncA基因的突變。結(jié)果 76株結(jié)核分支桿菌臨床分離株均經(jīng)PCR擴增出結(jié)核分支桿菌復合群保守序列IS6110基因片段，69株擴增出pncA基因的特異序列。后者包括：SSCP泳動異常者18株，其中耐藥株13株，敏感株5株；SSCP泳動正常者51株，其中耐藥株14株，敏感株37株。結(jié)論 青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌臨床分離株耐PZA主要分子機制之一為pncA基因的突變；PCRSSCP技術(shù)能快速準確地檢測結(jié)核分支桿菌耐PZA基因pncA的突變，可彌補常規(guī)藥敏試驗的不足。 【關(guān)鍵詞】 分支桿菌 結(jié)核 基因 pncA BACTEC培養(yǎng)方法 聚合酶鏈反應(yīng) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the mutations of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)resistance in Qingdao area. MethodsFrom 76 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis， the routine culture and drug susceptibility detection were done by BACTEC460 system， and the mutations of pncA gene detected by PCRSSCP.ResultsAmong the 76 isolates， 44 strains were PZAsensitive and 32 PZAresistant bythe BACTEC460 system. With PCRSSCP， 18 strains displayed abnormal pncA SSCP profile， in which， 13 were PZAeresistant and five PZAsensitive. Fiftyone strains displayed normal pncA SSCP profile， in which 14 were PZAresistant and 37 PZAsensitive. ConclusionMutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in pyrazinamideresistance of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. PCRSSCP appears to be a promising method for rapid detection of pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis， preferable to the routine drugsusceptibility test. ［KEY WORDS］Mycobacterium tuberculosis; genes， pncA; BACTEC; polymerase chain reaction; singlestrand conformation polymorphism 近年來，結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全球性明顯回升趨勢，其主要原因之一是耐藥菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的涌現(xiàn)。目前對結(jié)核分支桿菌耐藥分子機制的研究主要集中在各種藥物的作用靶位及其相關(guān)基因的突變位點上。吡嗪酰胺（PZA）自1949年首次用于肺結(jié)核治療以來，作為第一線抗結(jié)核藥物應(yīng)用已有50多年的歷史。近幾年結(jié)核分支桿菌臨床分離株對其耐藥趨勢日漸上升，并且呈現(xiàn)與異煙肼和利福平同時耐藥的現(xiàn)象［1］。然而，目前對PZA的作用機制及耐藥分子機制尚不清楚。本文應(yīng)用BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)進行結(jié)核分支桿菌常規(guī)培養(yǎng)和藥敏檢測，聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（PCRSSCP）檢測結(jié)核分支桿菌pncA基因，旨在了解青島地區(qū)結(jié)核分支桿菌耐PZA分離株的pncA基因突變情況，探討其與耐PZA之間的關(guān)系，以建立新的、快速有效的結(jié)核分支桿菌藥敏試驗方法，彌補常規(guī)藥敏試驗的不足。 1 材料和方法 1.1 標本來源 76例結(jié)核分支桿菌臨床分離株來自青島市結(jié)核肺病防治研究所2002年1～12月診治的肺結(jié)核病人。其中初治病人60例，復治病人16例；男43例，女33例；年齡21～83歲，平均52歲。 1.2 主要試劑與儀器 結(jié)核分支桿菌標準株（H37Rv）購自中國藥品生物制品檢定所，BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)試劑購自BECTONDICKINSON公司，dNTP、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR Marker均購自Promega公司，PCR擴增儀為PE公司480型。 1.3 痰標本的處理及PZA藥敏試驗 根據(jù)文獻［2］的方法進行菌種鑒定和藥敏試驗。痰標本經(jīng)消化、離心，接種至含有C14棕櫚酸的12B培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。第1周上機檢測生長指數(shù)（GI）值2～3次，以后每周測定1次，至第6周。結(jié)果判定標準如下：GI值0～10，培養(yǎng)陰性；GI值11～50，培養(yǎng)陽性；GI值51～100，可進行結(jié)核分支桿菌復合群與非結(jié)核分支桿菌鑒定；GI值500～800，可進行藥物敏感性試驗。 結(jié)核分支桿菌陽性標本一部分提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆茫涣硪徊糠衷?2B培養(yǎng)基內(nèi)加入定量PZA進行藥敏試驗，同時以蒸餾水代替PZA作為對照。按以下標準判定結(jié)果：對照組的生長指數(shù)(AGI)值>測試組的生長指數(shù)(△GI)值為敏感；AGI值<△GI值為耐藥；AGI值＝△GI值為臨界。 1.4 PCR檢測結(jié)核分支桿菌IS6110及pncA基因 1.4.1 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)Gene Bank中結(jié)核分支桿菌標準株H37Rv全基因序列，利用DNAStar軟件分別設(shè)計對應(yīng)于結(jié)核分支桿菌復合群保守序列IS6110及pncA基因序列的PCR引物。其中引物INS1和INS2擴增IS6110基因，引物pncA1和pncA2擴增pncA基因。引物序列及擴增片段長度見表1。引物由上海生工生物公司合成（PAGE純化），純水稀釋分裝，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?1.4.2 目的基因的PCR擴增 取經(jīng)BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)陽性的增菌液1.5 mL于無菌干燥玻璃試管中，酚氯仿法提取DNA。以提取的DNA為模板進行PCR擴增，其循環(huán)條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。表1 引物序列及其產(chǎn)物 1.5 PCRSSCP分析 pncA的PCR擴增產(chǎn)物變性后經(jīng)80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后可見野生型的單鏈DNA與H37Rv標準對照的單鏈DNA位于同一位置，而突變型的單鏈DNA低于或高于H37Rv標準對照的單鏈DNA水平，以此來確定突變例數(shù)。 2 結(jié)果 2.1 BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)檢測 從130份臨床痰標本中共檢出76株結(jié)核分支桿菌，陽性率為58.5%。其中對PZA敏感44株，耐藥32株，耐藥率為42.1%。 2.2 PCR擴增 本文76株結(jié)核分支桿菌臨床分離株均擴增出IS6110基因（245 bp）的目的條帶，與H37Rv標準株一致，表明這些臨床分離株均為結(jié)核分支桿菌。69株擴增出pncA基因的特異序列（254 bp）。7株未檢出pncA基因擴增產(chǎn)物，其中耐藥5株，敏感2株（圖1）。 2.3 PCRSSCP檢測結(jié)核分支桿菌pncA基因突變的結(jié)果 以結(jié)核分支桿菌標準株H37Rv為對照，69株結(jié)核分支桿菌臨床分離株中，SSCP泳動異常者18株，其中耐藥13株，敏感5株；泳動正常者51株，其中耐藥14株，敏感37株（圖2）。 2．4 PCRSSCP與BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)藥敏試驗結(jié)果比較 BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)藥敏試驗結(jié)果顯示，低度耐藥有8株SSCP泳動異常，13株SSCP泳動正常；高度耐藥有5株SSCP泳動異常，1株SSCP泳動正常。PZA耐藥株pncA基因突變率為48.1%（13/27），PZA敏感株pncA基因突變率為11.9%（5/42）。BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)PZA藥敏結(jié)果與PCRSSCP基因突變分析結(jié)果比較，差異無顯著性（χ2=3.37，P>0.05）。見表2。表2 BACTEC460 PZA藥敏結(jié)果與PCRSSCP分析結(jié)果的比較 3 討論 目前我國結(jié)核分支桿菌的實驗室診斷主要依靠涂片染色鏡檢和結(jié)核桿菌的培養(yǎng)與鑒定。 痰標本涂片染色鏡檢法簡單、快速，是臨床常規(guī)開展的方法，但敏感性較低，只能作為篩選。傳統(tǒng)的藥敏方法依靠直接或間接的含藥培養(yǎng)基進行結(jié)核分支桿菌的藥敏鑒定，僅能反映體外耐藥性的程度。由于各個實驗室所用培養(yǎng)基不同，檢測方法不同，結(jié)果判定標準不一，導致報道結(jié)果差異。而且由于結(jié)核分支桿菌生長緩慢，需較長時間方能獲得結(jié)果，耗時太長，因而不能滿足臨床需要［3］。 BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)是利用分支桿菌能夠分解C14棕櫚酸，產(chǎn)生14CO2的原理，自動檢測培養(yǎng)液中14CO2含量，并換算成GI值，由GI值的高低來判斷是否有細菌的生長。此種方法不僅提高了檢出率和分離速度，而且大大縮短了實驗周期。本實驗結(jié)果陽性率為58.5%。但由于此方法仍建立在細菌培養(yǎng)基礎(chǔ)上，結(jié)果回報日期仍較長，加之儀器價格昂貴，又具有放射性污染，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用，也不能滿足現(xiàn)代短程化療需要。由于PZA藥敏試驗需在酸性條件下(pH 5.0～5.5)進行，常用的改良羅氏培養(yǎng)基不能用于PZA藥敏試驗；BACTEC460培養(yǎng)系統(tǒng)檢測PZA藥敏試驗也需用特殊的酸性液體培養(yǎng)基，費用較高，長期以來國內(nèi)開展PZA藥敏常規(guī)試驗的單位很少，也缺乏統(tǒng)一的方法和判定標準。 目前，結(jié)核分支桿菌的耐藥機制及耐藥的分子基礎(chǔ)大部分已被闡明，建立了多種快速檢測結(jié)核分支桿菌耐藥基因型的分子生物學診斷技術(shù)。PCRSSCP操作簡單、快速，2 d內(nèi)即可獲得測定結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備和試劑，無放射性污染，無需限制性內(nèi)切酶，可直接對PCR擴增產(chǎn)物進行多態(tài)分析確認單鏈突變位點，并且檢出率相對較高，已成為目前應(yīng)用最廣泛的突變檢測技術(shù)之一。

［2］中國防癆協(xié)會. 結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程［J］. 中國防癆雜志， 1996(1):31.

［3］付娟，張彥梅. 聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測結(jié)核桿菌［J］. 山西醫(yī)科大學學報， 1998，29(2):191192.

［4］SCORPIO A， LINDHOLMLEVY P， HEIFETS L， et al. Characterization of pncA mutations in pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis ［J］. Antimicrob Agents Chemother， 1997，41:540543.［5］SREEVATSAN S， PAN X，ZHANG Y， et al. Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of Mycobacterium tuberculosis complex organisms ［J］. Antimicrob Agents Chemother， 1997，41:636640.

［6］HOE L， OSEIHYIAMAN D， ZHANG Z， et al. Molecular characterization of pncA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from China ［J］. Epidemiol Infect， 2000，124(2):227232.

［7］吳雪瓊，張俊仙，鐘敏，等. 結(jié)核分支桿菌耐PZA分離株pncA基因突變的研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志， 2000，23:4042.

［8］李洪敏，吳雪瓊，王巍，等. 分析5種結(jié)核桿菌耐藥基因突變與耐藥水平的關(guān)系［J］.中華微生物學和免疫學雜志， 2002，22:644646.

［9］王巍，李洪敏，吳雪瓊，等. 用耐藥基因檢測方法指導老年肺結(jié)核病人治療的臨床研究［J］.中國老年學雜志， 2003，23:7880.

［10］LEE A S， TANG L L， LIM I H， et al. Characterization of pyrazinamide and of loxacin resistance among drug resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Singapore ［J］. Int J Infect Dis， 2002，6(1):4851.

［11］BISHOP K S， BLUMBERG L， TROLLIP A P， et al. Characterization of the pncA gene in Mycobacterium tuberculosis isolates from Gauteng， South Africa ［J］. Int J Tuberc Lung Dis， 2001，5(10):952957.

［12］MESTDAGH M， REALINI L， FONTEYNE P A， et al. Correlation of pncA sequence with pyrazinamide resistance level in BACTEC for 21 Mycobacterium tuberculosis clinical isolates ［J］. Microb Drug Resist， 2000，6(4):283287.

［13］BAMAGA M， WRIGHT D J， ZHANG H. Selection of in vitro mutants of pyrazinamideresistant Mycobacterium tuberculosis ［J］. Int J Antimicrob Agents， 2002，20(4):275281.

［14］BAMAGA M， ZHANG H， WRIGHT D J. New mutations in pncA of in vitro selected pyrazinamideresistant strains of Mycobacterium tuberculosis ［J］. Microb Drug Resist， 2001，7(3):223.