【摘要】 目的：探討外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜對紅霉素耐藥性中的作用. 方法：從野生菌株中克隆msrA基因全長，并通過穿梭載體pBT2電轉(zhuǎn)化至限制缺陷菌株金黃色葡萄球菌RN4220，提取質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)化S.epidermidis 1457（ica+， 產(chǎn)膜陽性菌），得到S. epidermidis 1457msrA. 實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測S. epidermidis 1457msrA和野生株S68浮游菌、生物被膜內(nèi)細(xì)菌紅霉素作用24 h前后msrA mRNA的表達(dá). 結(jié)果：表葡膜內(nèi)菌msrA的表達(dá)在紅霉素（10倍MIC）作用前后未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 結(jié)論：提示膜內(nèi)菌對紅霉素耐藥性的增加可能與外排泵基因的上調(diào)無關(guān). 【關(guān)鍵詞】 表皮葡萄球菌 物被膜 紅霉素 耐藥性 0 引言 表皮葡萄球菌（簡稱表葡菌）引發(fā)的醫(yī)院感染已得到人們的日益關(guān)注，雖然表葡菌分泌的毒性因子較金黃色葡萄球菌少，但其粘附在多聚材料上，形成生物被膜而引發(fā)的感染卻呈現(xiàn)慢性、持續(xù)性、反復(fù)性和難治性的特點(diǎn)［1］. 生物被膜的產(chǎn)生使膜內(nèi)菌對抗生素的耐藥性比浮游菌增加10～1000倍， 其引發(fā)的感染常常只有移走植入物才能控制［2］，但其對抗生素的耐藥機(jī)制目前還不十分清楚. 外排泵msrA是浮游葡萄球菌對MLSB類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一， 我們探討外msrA在生物被膜內(nèi)細(xì)菌對紅霉素耐藥性中的作用如下： 1 材料和方法 1．1 限制缺陷型菌株 Staphylococcus aureus RN4220，Staphylococcus epidermidis 1457(產(chǎn)生物被膜， ica+， 紅霉素MIC 0.25 mg/L)和穿梭載體pBT2由美國Micheal Otto教授惠贈(zèng)；野生株S68（產(chǎn)生物被膜，msrA+， 紅霉素耐藥MIC 32 mg/L）. 根據(jù)msrA全長（GenBank No.X52085），設(shè)計(jì)引物并在兩端加SalⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)（F 5′ AAAAGTACT gat ctt tgt act tag aga tat3′；R 5′ CGGGATCC gat cgg tta tgg tac tat tg3′），以菌株S68為模板擴(kuò)增msrA， PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 1 min，46℃ 1 min，72℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)后，72℃ 7 min. PCR產(chǎn)物凝膠純化后，連于pMD18T載體并測序驗(yàn)證. 將pMD18TmsrA質(zhì)粒和pBT2質(zhì)粒用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后，將長度為2.0 kb的msrA片段和6.9 kb的pBT2質(zhì)粒DNA片段連接后，轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含Amp（100 mg/L）和Em（20 mg/L）的LB瓊脂平板篩選，挑選菌落增菌提取質(zhì)粒后，用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定；同時(shí)PCR擴(kuò)增msrA鑒定. DL2000 DNA maker， Taq酶（DRR001A）和PCR試劑均購自TaKaRa公司. 1.2.1 S. epidermidis 1457pBT2/msrA株的構(gòu)建 取S. epidermidis 1457新鮮增菌液1 mL接種于25 mL B medium（含蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖1 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L） 37℃震蕩培養(yǎng)至A600 nm 0.8. 收集細(xì)菌用滅菌三蒸水和100 mL/L甘油溶液洗滌后，用800 μL甘油(100 mL/L)溶液懸起，以每管70 μL分裝于滅菌Eppendorf管，-70℃保存. 取-70℃保存的金黃色葡萄球菌RN4220感受態(tài)細(xì)胞于室溫融化. 每管加入重組質(zhì)粒pBT2+msrA 6 μL（100 mg/L），輕輕混勻，室溫放置30 min，將細(xì)菌轉(zhuǎn)入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯，電擊1次（電壓2 kV，電容25 μF，電阻100 Ω），通電時(shí)間約為2.4 ms. 迅速加入0.9 mL B medium懸起細(xì)菌， 37℃震蕩培養(yǎng)3 h，取100 μL涂于含 Cm （20 mg/L）的B medium瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)24 h后，挑取克隆，接種到5 mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)12～16 h，用Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，SalⅠ和BamHⅠ酶切鑒定. 采用Qiagen plasmid midi kit從金黃色葡萄球菌RN4220中提取50～100 μg質(zhì)粒，按上述方法電轉(zhuǎn)化S. epidermidis 1457感受態(tài)細(xì)胞，用含Cm （10 mg/L）和Em（10 mg/L）的B medium瓊脂平板篩選陽性克隆. 1.2.2 S. epidermidis 1457msrA的鑒定 提取質(zhì)粒用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定. 提取基因組DNA，PCR鑒定: msrA（1887 bp）引物同前和 icaA（814 bp）引物為：5′GACCTCGAAGTCAATAGAGGT3′，5′CCCAGTATAACGTTGGATACC3′. 95℃變性5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min；肉湯稀釋法測量S. epidermidis 1457和S. epidermidis 1457msrA菌株的紅霉素最小抑菌濃度， 按常規(guī)方法操作，標(biāo)準(zhǔn)菌株Staphylococcus epidermidis ATCC12228; 采用KB紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測S. epidermidis 1457和S. epidermidis 1457msrA株對氨芐西林、苯唑西林、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素的藥物敏感性，根據(jù)抑菌環(huán)直徑的大小按NCCLS（2005）標(biāo)準(zhǔn)判讀. 將S. epidermidi 1457和S. epidermidis 1457msrA株接種于剛果紅 ［3］ 培養(yǎng)板，檢測其產(chǎn)膜特性. 1.2.3 細(xì)菌生物被膜的形成［4］和實(shí)時(shí)定量RTPCR 將新鮮增菌液稀釋至光密度為0.2（600 nm），取5 μL接種于已置于B medium平板上的0.2 μm聚碳酸酯微孔濾膜上（直徑約25 mm），35℃孵育48 h，濾膜及所生成的生物被膜每隔12 h轉(zhuǎn)移到新的平板上. 聚碳酸酯微孔濾膜（Whatman Inc，USA）購于聯(lián)星生物有限公司，使用前121℃高壓15 min. 生物被膜形成后轉(zhuǎn)移至含紅霉素的B medium平板上（10倍MIC），并在紅霉素作用24 h前后取樣，放入細(xì)菌RNA保護(hù)液（Qiagen）中， 盡快提取總RNA. 將S. epidermidis 1457msrA和S68菌株增菌24 h后的浮游菌和生物被膜紅霉素作用前后樣品，用Qiagen RNeasy mini kit提取總RNA. 使用RNasefree DNase set （Qiagen）去除樣品中的基因組污染. 采用Takara SYBR ExScriptTM RTPCR Kit進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測浮游菌，膜內(nèi)菌紅霉素作用前后msrA基因的表達(dá)，以16S rRNA為內(nèi)對照. 采用DNAstar設(shè)計(jì)引物為：msrA 5′ AAGCCAGTAAAGCTAAACGAAATC 3′，5′ TTTTGATGCACTTAAACGATCTGG 3′；16S rRNA 5′ CCATGTGTAGCGGTGAAATGC 3′，5′ ACATCAGCGTCAGTTACAGACC 3′. 使用1457msrA浮游菌總RNA樣品轉(zhuǎn)錄成cDNA梯度稀釋為100， 10， 1， 0.1， 0.01 ng/L作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，制作16sRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和cDNA梯度稀釋為100， 10， 1， 0.1， 0.01 μg/L作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線. 檢測各標(biāo)本Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品目的基因的濃度，分別用16S rRNA和1457浮游菌各目的基因表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)獲得相對表達(dá)量. 使用沒有逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)作為對照鑒別是否有基因組污染. 操作時(shí)每份樣品重復(fù)3次. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，采用CHISS 2004統(tǒng)計(jì)軟件組內(nèi)前后比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用t(t′)檢驗(yàn). 2 結(jié)果 2．1 重組質(zhì)粒pBT2msrA電轉(zhuǎn)入S.epidermidis 1457 全長msrA（1887 bp）從野生菌株S68中擴(kuò)增后，克隆入pMD18T，測序驗(yàn)證其序列的正確性；將序列正確的msrA克隆入pBT2（6970 bp)載體，篩選出的陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，分別得到6970 bp和1887 bp的DNA片段，證明pBT2msrA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）. 首先將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入金黃色葡萄球菌RN4220，經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，0.8 g/L瓊脂糖電泳證明正確后，從RN4220中抽提高濃度的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入S.epidermidis 1457，經(jīng)抽提質(zhì)粒酶切、電泳證明分別為6970 bp和1887 bp片段（圖2）. KB紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測其對氨芐西林、苯唑西林、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素藥物均敏感，與S.epidermidis 1457相同；對紅霉素耐藥，最小抑菌濃度為16 mg/mL； msrA（1887 bp）和icaA PCR（814 bp）擴(kuò)增陽性（圖3）；剛果紅培養(yǎng)均產(chǎn)黑色帶干結(jié)晶體菌落. 2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR 表葡菌1457msrA和野生株S68膜內(nèi)菌紅霉素作用前后msrA表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05， 表1）.表1 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測表葡菌1457和S68 msrA表達(dá)水平aP<0.05 vs膜內(nèi)菌EM作用前.

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