作者：韓英時永全鄭悅張宏博樊代明

【關(guān)鍵詞】 蛋白激酶

關(guān)鍵詞: 蛋白激酶C;同工酶;胃癌;多藥耐藥

摘 要:目的 觀察傳統(tǒng)型蛋白激酶C（cPKCs）在胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR1.0、耐藥亞系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7及藥敏細(xì)胞系SGC7901表達(dá)及活性的變化，以及對細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的影響. 方法 用免疫熒光化學(xué)及蛋白印跡方法觀察傳統(tǒng)型蛋白激酶C在胃癌耐藥細(xì)胞系及藥敏細(xì)胞系的表達(dá);競爭蛋白結(jié)合法測定PKC的活性;應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的變化. 結(jié)果 PKCα，PKCβⅠ ，PKCβ Ⅱ 及PKCγ在胃癌耐藥細(xì)胞系及藥敏細(xì)胞系均有表達(dá)，PKCα在耐藥細(xì)胞表達(dá)呈強陽性，在藥敏細(xì)胞表達(dá)呈陽性;PKCβⅠ 及PKCβⅡ 在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞表達(dá)均為陽性;PKCγ在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞表達(dá)均為強陽性.免疫蛋白印跡實驗證實，隨耐藥指數(shù)的增加，PKCα表達(dá)呈逐漸增高的趨勢，薄層掃描蛋白印跡帶的吸光度（A）分別為9584.17，9421.06，8534.64，8088.79，而PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐藥細(xì)胞系、耐藥亞系及其藥敏細(xì)胞系表達(dá)無明顯變化.PKC活性檢測結(jié)果提示，隨耐藥指數(shù)的增加，PKC活性呈逐漸增高的趨勢，以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的PKC活性增高為主. 結(jié)論 傳統(tǒng)型蛋白激酶C在維持胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR的多藥耐藥中起重要作用且具有同工酶特異性.

Keywords:protein kinase C;isoenzyme;gastric cancer;mul-tidrug resistance

Abstract:AIM To observe the expression and activity of classic protein kinase C in gastric cancer cell SGC7901and its drug-resistant sublines SGC7901/VCR slected by vincristine of different concentration（0.3，0.7and1.0μg?mL-1 ）.To explore the effect of classic protein kinase C on drug concen-tration within gastric cancer cells.METHODS The expres-sion of classic protein kinase C in gastric cancer cells was de-termined by immuno-fluorescent method and Western blot.The PKC activity was determined by competed protein bind-ing method.The drug concentration within cells was deter-mined by FACS.RESULTS Both SGC7901and SGC7901/VCR cells exhibited positive staining of PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ and PKCγ.The staining of PKCαin SGC7901/VCR was much stronger than that in SGC7901.There were no dif-ferences in the expression of PKCβⅠ ，PKCβⅡ and PKCγbe-tween SGC7901and SGC7901/VCR.By using Western blot，continuous increasing expression of PKCαin SGC7901/VCR was demonstrated along with the increasing resistant index，as well as no differences between SGC7901and its drug-resis-tant sublines.Results of activity assay showed continuous in-creasing activity of PKC in gastric cancer cells along with in-creasing resistant index.CONCLUSION Classic protein ki-nase C plays an important role in multidrug resistance of gas-tric cancer cells with isoenzyme specificity.

0 引言

蛋白激酶C是一類廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前發(fā)現(xiàn)至少有12種同工酶亞型.按其生化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)可分為四大類.由鈣、磷酯（PL）、二酰基甘油（DAG）或佛波酯激活的PKC為傳統(tǒng)型（cPKCs）;不依賴鈣而由PL，DAG或佛波酯活化的PKC類為新型（nPKCs）;僅由PL類物激活的為非典型型（aPKCs）;PKCμ不需鈣、DAG激活，而由磷酯酰肌醇-4，5二磷酸激活，但在結(jié)構(gòu)上與前三種部分類似，故稱為第四種PKC［1，2］ .PKC具有異質(zhì)性，不同的PKC亞類位于不同類型的細(xì)胞以及同一細(xì)胞內(nèi)的不同部位，因而表現(xiàn)出不同的功能.近期研究提示，cPKCs可能參與了多藥耐藥的形成且具有同工酶特異性.本研究擬觀察cPKCs在胃癌耐藥細(xì)胞系、耐藥亞系和藥敏細(xì)胞系的表達(dá)及活性的變化以及對細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的影響，以進(jìn)一步揭示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PKC在多藥耐藥發(fā)生中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 SGC7901細(xì)胞系由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈，耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR1.0及其耐藥亞系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7由本室誘導(dǎo).兔抗人PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司;羊抗兔IgG-FITC購自中山公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢博士德公司;PKC活性分析試劑盒購自Gibcobrl公司;［γ-32 P］ATP購自北京亞輝公司.細(xì)胞生長于含100mL?L-1 已滅活小牛血清的RP-MI1640培養(yǎng)液中，37℃，50mL?L-1 CO2 的條件下培養(yǎng)，耐藥細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0.3，0.7和1mg?L-1 長春新堿以維持耐藥表型，用于實驗前耐藥細(xì)胞在不加長春新堿的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2wk.

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光化學(xué) 取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR及藥敏細(xì)胞SGC7901，用2.5g?L-1 的胰酶消化傳代于裝有載玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，用PBS沖洗3次，冷丙酮固定［3，4］ .PBS洗3次，加50mL?L-1 H2 O2 室溫15min，水洗3次;3mL?L-1 Triton X-100室溫15min，吸去不洗;1∶10的血清封閉30min，吸去不洗;分別加兔抗人多克隆抗體PKCα（2mg?L-1 ），PKCβⅠ （2mg?L-1 ），PKCβⅡ （4mg?L-1 ）及PKCγ（4mg?L-1 ），37℃孵育1h，PBS洗3次;加羊抗兔IgG-FITC（1∶60），37℃孵育1h，PBS洗3次，用500mL?L-1 的緩沖甘油封片.實驗同時設(shè)PBS或無關(guān)抗體為替代一抗的陰性對照.

1.2.2 Western blot 收獲對數(shù)生長期的細(xì)胞并用冷PBS清洗2次，以裂解緩沖液［50mmol?L-1 Tris-Cl（pH7.5），150mmol?L-1 NaCl，0.2mmol?L-1 EDTA，1mmol?L-1 PMSF和10g?L-1 NP-40］裂解細(xì)胞制備細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度;取150μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，麗春紅S染色并標(biāo)記蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);去離子水漂去麗春紅后以50g?L-1 脫脂奶粉于室溫1h封閉濾膜，常規(guī)分別結(jié)合兔抗人PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ多克隆抗體、辣根過氧化物 酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，最后以DAB顯色目的條帶.

1.2.3 PKC活性檢測 參照文獻(xiàn)［5］并進(jìn)行改良取對數(shù)生長期的耐藥細(xì)胞系、耐藥亞系及藥敏細(xì)胞系，用2.5g?L-1 的胰酶消化傳代于10cm的培養(yǎng)皿中，至對數(shù)生長期，冷PBS沖洗2次后，用細(xì)胞刮收取細(xì)胞，加Buffer A1mL（Tris/EGTA/EDTA，β-巰基乙醇、蛋白酶抑制劑），用超聲粉碎機(jī)粉碎，每次20s，共3次，然后1000g離心15min，沉淀部分超聲粉碎后12000g離心10min，所得上清為細(xì)胞核部分;上清100000g4℃離心1h，所得上清為細(xì)胞質(zhì)PKC部分;所得沉淀部分加含10mL?L-1 Triton X-100的BufferA抽提細(xì)胞膜PKC30min，每10min震蕩1次，然后進(jìn)行超聲粉碎.蛋白定量用Bradford法，活性檢測步驟按試劑盒要求進(jìn)行，所測活性為cPKCs的總活性，PKC比活性用nmol?g-1 ?min-1 表示.

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)藥物濃度 參照文獻(xiàn)［6，7］進(jìn)行.取對數(shù)生長期細(xì)胞用2.5g?L-1 胰酶消化成單細(xì)胞懸液，接種6孔板并繼續(xù)培養(yǎng)48h.加阿霉素至終濃度為5mg?L-1 ，繼續(xù)培養(yǎng)1h，冷PBS洗3次，用細(xì)胞刮收獲細(xì)胞離心，再以冷PBS重新懸浮，保存于4℃，上流式細(xì)胞儀檢測.激發(fā)波長為488nm，接收波長為575nm.

統(tǒng)計學(xué)處理:用方差分析.

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光化學(xué) PKCα在耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR表達(dá)呈強陽性，在藥敏細(xì)胞系SGC-7901表達(dá)呈陽性;PKCβⅠ 及PKCβⅡ 在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞表達(dá)均呈陽性;PKCγ在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞表達(dá)均呈強陽性.

2.2 Western blotting PKCα在耐藥細(xì)胞系及耐藥亞系較其藥敏細(xì)胞系表達(dá)明顯增加，隨耐藥指數(shù)的增加PKCα表達(dá)呈逐漸增加的趨勢，薄層掃描蛋白印跡帶的吸光度（A）分別為9584.17，9421.06，8534.64和8088.79（Fig1）.PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞無明顯差異（Fig1）.

2.3 PKC活性檢測結(jié)果 胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR及其耐藥亞系與其藥敏細(xì)胞比PKC活性明顯增高，其中以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核PKC活性增高比較明顯（Tab1）.

2.4 細(xì)胞內(nèi)藥物濃度 胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR及其耐藥亞系與其藥敏細(xì)胞系比細(xì)胞內(nèi)藥物濃度明顯減低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），隨耐藥指數(shù)的增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度呈逐漸減低的趨勢. 圖1 略

表1 胃癌耐藥細(xì)胞系及其藥敏細(xì)胞PKC活性略

3 討論

傳統(tǒng)型蛋白激酶C，即鈣、磷酯依賴的蛋白激酶C，包括4種同工酶亞型PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ，Mr 80000～90000.cPKCs亞型分布有明顯的組織特異性，如胰腺表達(dá)PKCα，PKCβⅡ ，而無PKCβⅠ 及PKCγ的表達(dá);腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PKCα，而間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PKCβⅠ 和PKCγ;人白血病細(xì)胞表達(dá)PKCα，PKCβ和PKCγ.不同PKC亞型選擇性器官分布提示它們在功能上的差異，多種亞型可在同一組織甚至同一細(xì)胞中存在，并介導(dǎo)不同的信號傳遞功能.我們觀察了cPKCs在胃癌耐藥細(xì)胞系及其藥敏細(xì)胞系的表達(dá)［8］ ，PKCα在耐藥細(xì)胞表達(dá)呈強陽性，在藥敏細(xì)胞表達(dá)呈陽性;PKCβⅠ ，PKCβⅡ 在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞表達(dá)均呈陽性;PKCγ在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì)胞表達(dá)均呈強陽性.蛋白印跡實驗證實，隨耐藥指數(shù)的增加，PKCα的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢，而PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐藥細(xì)胞及藥敏細(xì) 胞的表達(dá)無明顯差異.提示PKCα在維持胃癌細(xì)胞的耐藥表型中可能起重要作用.

有研究表明，在體外建立的耐藥細(xì)胞株，較相應(yīng)的敏感株蛋白激酶C活性明顯增高［9］ .近年來也有研究表明耐藥細(xì)胞系PKC的表達(dá)及活性較其藥敏細(xì)胞系減低，但有趣的是這些細(xì)胞的基礎(chǔ)PKC表達(dá)及活性水平與細(xì)胞耐藥后PKC活性增高的細(xì)胞比高出許多倍，提示如果PKC活性的基礎(chǔ)水平比較高，MDR表達(dá)不一定伴有PKC活性的增高［10］ .上述事實說明，腫瘤細(xì)胞獲得MDR后，PKC活性的改變可能取決于親代細(xì)胞本身的特性以及所誘導(dǎo)的藥物類型.我們檢測了胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR1.0，SGC7901/VCR0.7及SGC7901/VCR0.3及其藥敏細(xì)胞SGC7901的PKC活性，提示細(xì)胞耐藥后PKC總活性、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的活性明顯增高，隨耐藥指數(shù)的增加呈逐漸增高的趨勢，細(xì)胞膜的PKC活性無明顯改變.可能是因為化療藥物長期誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞導(dǎo)致PKC的表達(dá)增加，而PKC通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)，無化療藥物及其他刺激時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PKC含量較多，所以檢測到的結(jié)果細(xì)胞耐藥后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PKC的活性較高而細(xì)胞膜的活性無明顯變化，細(xì)胞核內(nèi)PKC活性的增高可能與維持MDR表型蛋白的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)有關(guān).

MDR經(jīng)常與PKC的水平和活性有關(guān).從我們的實驗結(jié)果也可以看出，PKC活性水平的升高與PKCα的表達(dá)有明顯的相關(guān)性，隨耐藥指數(shù)的增加PKC的活性及PKCα的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度呈逐漸減低的趨勢，更進(jìn)一步說明PKCα在維持胃癌細(xì)胞的耐藥表型中起重要作用.無論如何，對于PKC不同同工酶亞型與胃癌多藥耐藥性相關(guān)性的研究，為進(jìn)一步明確胃癌的多藥耐藥機(jī)制以及選擇逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物將會提供有益的幫助.

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