作者：周慧，馬越鳴石榮，閆晶超

【摘要】 目的研究瀉心湯不同配伍黃酮類成分在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的差異。方法大鼠隨機(jī)分為4組，分別灌胃給予瀉心湯(XXD)，單味黃芩(RS)，大黃+黃芩(RRR+RS)和黃連+黃芩(CC+RS)，給藥前及給藥后不同時(shí)間采集血樣，HPLC法測(cè)定黃芩苷和漢黃芩苷濃度，由血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，比較組間差異。結(jié)果與RS組相比，其余3組中黃芩苷的AUC和Cmax數(shù)值均有不同程度的降低;而CC+RS組中漢黃芩苷的AUC和Cmax數(shù)值與RS組相比亦有明顯減少。結(jié)論瀉心湯配伍(黃連和大黃)可能使黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷的吸收減少、暴露水平降低，其中黃連的影響更明顯。

【關(guān)鍵詞】 瀉心湯; 黃酮類; 配伍; 藥代動(dòng)力學(xué)

Abstract：ObjectiveTo investigate the pharmacokinetic profile of the baicalin and wogonoside in rats after oral administration of Xiexin Decoction (XXD)and the different combinations of its constituent herbs. MethodsRats were pided into four groups and were randomly administered one of the four aquous extracts: RS， RS + RRR， RS+CC and XXD (RS+RRR+CC) via intragastric gavage. Plasma concentrations of Baicalin and wogonoside were measured by HPLC. Pharmacokinetic parameters were calculated from the plasma concentration-time data.ResultsThe Cmax and AUC of baicalin and wogonoside were significantly different among the four groups. Compared with the group of RS alone， the rest three groups， RS+CC， RS + RRR and RS+RRR+CC (XXD)， showed a decrease in AUC and Cmax of the baicalin and RS+CC group showed a decrease in the AUC and Cmax of wogonoside.ConclusionThe results suggested that CC and RRR may markedly decrease the absorption and systematic exposure levels of baicalin and wogonoside in RS， and CC has more profound effect.

Key words： Xiexin Decoction; Flavonoids; Compatibility; Pharmacokinetics

瀉心湯(Xiexin Decoction)為出自《金匱要略》的清熱經(jīng)典名方，由大黃、黃芩、黃連組成，具有抗炎[1]、抗病原微生物、抗凝、改善高血壓及高脂血癥、保護(hù)胃黏膜等藥理作用[2]。關(guān)于瀉心湯配伍成分的研究報(bào)道有很多，如應(yīng)用HPLC測(cè)定黃芩苷-小檗堿沉淀物在不同條件下的平衡濃度[3]等。但是在瀉心湯不同配伍中黃酮成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究未見報(bào)道。

黃芩(Radix Scutellariae)為唇形科植物黃芩Scutellria baicalensis Georgi.的干燥根。味苦，性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。黃芩有效成分為黃酮類，主要包括黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)、漢黃芩苷(wogonoside)、漢黃芩素(wogonin)等(圖1)。文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩苷由于極性大不能直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收入血，而是在腸道菌群的葡萄糖醛酸苷酶作用下轉(zhuǎn)化為其苷元即黃芩素，黃芩素進(jìn)入腸黏膜后，在UDPG-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為黃芩素-葡萄糖醛酸結(jié)合物(恰好與原型黃芩苷結(jié)構(gòu)一致)，再主要以黃芩苷的形式經(jīng)腸道吸收入血，進(jìn)入血液的黃芩素還可在肝臟經(jīng)UDPG-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化生成黃芩素-葡萄糖醛酸結(jié)合物(即黃芩苷)[4～8]。體內(nèi)的黃芩苷又可經(jīng)膽汁和腸黏膜[9，10]轉(zhuǎn)運(yùn)至腸腔，經(jīng)歷再循環(huán)過程。由于黃芩苷的這種吸收和代謝特性，當(dāng)大鼠灌胃給予黃芩苷或黃芩素時(shí)，通常在血漿里能夠迅速檢測(cè)到黃芩苷，而黃芩素的濃度很低或無法檢測(cè)到[11，12]。漢黃芩苷的體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程與黃芩苷類似[13]。由此可見，大鼠灌胃給予黃芩提取物后，進(jìn)入體循環(huán)的主要是黃芩苷和漢黃芩苷。因此，本實(shí)驗(yàn)研究瀉心湯及其不同配伍在大鼠體內(nèi)黃芩苷和漢黃芩苷的血藥動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent HP1100高效液相色譜儀系統(tǒng)：配有二元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜工作站;XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);USC-502超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司);FA2004N分析天平(上海精密科學(xué)有限公司);TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品及配制黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為三蒸水。

大黃，黃芩和黃連，購(gòu)自上海康橋中藥飲片有限公司，經(jīng)本校生藥教研室趙志禮教授鑒定，按2∶1∶1比例，傳統(tǒng)方法煎煮，標(biāo)準(zhǔn)化制備過程制成瀉心湯和各不同配伍組提取物細(xì)粉，由本校科技實(shí)驗(yàn)中心中藥制藥室制備。各提取物中活性成分及含量用HPLC法分析測(cè)定[14]。

1.3 動(dòng)物SD大鼠，250～280 g，雌雄各半，合格證號(hào)：SYXK(滬) 2004-2005，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。

2 方法

2.1 色譜條件色譜柱為SUPELCO Discovery C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為2%甲酸0.1%三乙胺-乙腈(77∶23，V∶V);流速1.0 ml·min-1;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)277，318 nm;進(jìn)樣體積50 μl。

2.2 樣品預(yù)處理取血漿0.1 ml，加入內(nèi)標(biāo)18 μg/ml對(duì)羥基苯甲酸甲酯10 μl，加入1 mmol·L-1KH2PO4溶液50 μl，振蕩混勻;加入甲醇∶乙腈(1∶1)100 μl，36%乙酸5 μl渦漩10 min，離心(16 000 r·min-1)20 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性血漿色譜圖(圖2)表明，空白血漿在與對(duì)照品相同保留時(shí)間處沒有檢出色譜峰，黃酮類成分與其它成分達(dá)到基線分離，說明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及瀉心湯中其它成分均不干擾黃酮類成分的檢出。

2.3.2 線性范圍及定量限制備黃芩苷、漢黃芩苷濃度分別為0，0.1，0.5，2.0，5.0，7.0，10.0 mg·L-1及0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mg·L-1血漿樣品，按“2.2項(xiàng)”下血漿樣品預(yù)處理的方法操作，用樣品濃度X對(duì)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比Y作直線回歸，得黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y= 0.458X+0.017 95(r= 0.998 4， n= 5);漢黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y= 0.885X+0.045 97(r= 0.996 8， n= 5)。黃芩苷和漢黃芩苷血漿濃度分別在0.1～10.0 mg·L-1及0.1～8.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好，定量下限(LLOQ)均為0.1 mg·L-1。

2.3.3 精密度、準(zhǔn)確度與回收率制備黃芩苷濃度為0.1，5.0，10.0 mg·L-1和漢黃芩苷濃度為0.2，1.0，8.0 mg·L-1血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下操作，批內(nèi)平行5份，用于評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和批內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算批間精密度。低、中、高3個(gè)濃度的準(zhǔn)確度(n=5)黃芩苷為92.6%，93.1%和92.0%;漢黃芩苷為117.7%，103.6%和91.0%。3個(gè)濃度的批內(nèi)精密度(n= 5)黃芩苷為4.1%，8.2%和1.6%;漢黃芩苷為16.9%，5.8%和12.7%，批間精密度(n=5)黃芩苷為4.2%，1.5%和1.7%;漢黃芩苷為7.4%，3.9%和2.2%。另取超純水加入黃芩苷和漢黃芩苷，使其濃度與血漿樣品相同，按 “2.2”項(xiàng)下血漿樣品的預(yù)處理操作，得標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積比，求得低、中、高3個(gè)濃度血漿提取回收率(n=5)黃芩苷為58.5%，81.4%和68.8%;漢黃芩苷為84.2%，80.9%和76.0%。

2.3.4 穩(wěn)定性配制與“2.3.3”項(xiàng)濃度相同的黃芩苷、漢黃芩苷血漿樣品，在- 70 ℃條件下存放 3 d，室溫放置20 h，凍融1次。按照“2.2”項(xiàng)下預(yù)處理操作，結(jié)果在以上條件下各濃度樣品測(cè)定值的RSD均小于15%，這表明在此條件下黃酮類成分穩(wěn)定性良好。血漿樣本按此條件保存及測(cè)定。

2.3.5 方法學(xué)質(zhì)控在生物樣本分析方法確證完成以后開始測(cè)定未知樣品，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制。每個(gè)分析批生物樣品測(cè)定隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行3濃度雙樣本質(zhì)控樣品分析，并將質(zhì)控樣品變異<15%作為當(dāng)日數(shù)據(jù)是否接受的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 瀉心湯不同配伍中黃酮類成分(黃芩苷、漢黃芩苷)在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)SD大鼠28只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組7只，分別灌服瀉心湯、單味黃芩、大黃+黃芩以及黃芩+黃連提取物水溶液(各組給藥劑量及活性成分含量見表1)。本實(shí)驗(yàn)中瀉心湯的給藥劑量為12 g(生藥)·kg-1，與大鼠灌服瀉心湯的有效劑量相同[15]，為人用等效劑量的2倍[16]。各組分別于給藥前及給藥后5，10，20 min及0.5，1，2，4，6，8，12，16，24，28，32 h于眼球后靜脈叢采血，肝素抗凝9 600 r·min-1離心制備血漿，吸取血漿，-20℃保存，按照上述方法測(cè)定，由隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃芩苷、漢黃芩苷的血藥濃度。

a.標(biāo)準(zhǔn)品;b.空白血漿;c.空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品;d～f：給藥后10 min血漿[給予黃芩(d)、瀉心湯(e)、黃芩+大黃(f)和黃芩+黃連(g)]

2.5 數(shù)據(jù)分析各組大鼠給藥后血漿色譜圖與瀉心湯及空白血漿色譜圖進(jìn)行對(duì)比，并通過與黃酮類成分(黃芩苷、漢黃芩苷)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比確認(rèn)，分析給藥后血漿中黃酮類成分。

黃芩苷、漢黃芩苷的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用非房室模型， DAS 2.0程序進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析，用統(tǒng)計(jì)矩法求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。采用梯形法計(jì)算AUC0-t;AUC0-∞ = AUC0-t + Ct/ke，其中Ct為最末點(diǎn)的血藥濃度。數(shù)據(jù)以±s表示，各組動(dòng)力學(xué)參數(shù)間的差異用方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

各組大鼠分別灌服瀉心湯、單味黃芩、大黃黃芩以及黃芩黃連后，血漿中可檢測(cè)到的黃酮類成分主要為黃芩苷、漢黃芩苷(圖2)，其對(duì)應(yīng)的苷元黃芩素、漢黃芩素均未檢測(cè)到。黃芩苷、漢黃芩苷的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。

結(jié)果表明黃芩苷、漢黃芩苷可迅速吸收進(jìn)入體內(nèi)，5 min即可檢測(cè)到。并隨時(shí)間呈動(dòng)態(tài)變化，藥時(shí)曲線呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。在4個(gè)給藥組中，黃芩苷在體內(nèi)的血藥濃度均高于漢黃芩苷。在瀉心湯中和其他黃芩配伍中，黃芩苷分別在給藥后28 h和32 h后血藥濃度降至定量限下;而在黃芩+黃連組和其他3組中，漢黃芩苷分別在給藥后28 h和32 h后血藥濃度降至定量限下。

黃芩苷和漢黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2～3。兩者的Cmax 和 AUC組間差異明顯(P<0.05或 P< 0.01)。與單味黃芩組相比，其余3組(黃芩+大黃、黃芩+黃連、瀉心湯)中黃芩苷的AUC數(shù)值顯著降低，分別相當(dāng)于黃芩組AUC的52.6%， 42.9%和41.4%，其余3組Cmax1也明顯降低;且黃芩+黃連組和瀉心湯組中黃芩苷的Cmax也顯著降低;黃芩配伍黃連后，漢黃芩苷的Cmax 和 AUC明顯減小。與黃芩+黃連組相比，瀉心湯組的黃芩苷和漢黃芩苷的Cmax1均有所升高。表2 大鼠口服瀉心湯等的黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與RS組比較，aP< 0.05， bP< 0.01; 與RS+CC組比較，cP< 0.05表3 大鼠口服瀉心湯等的漢黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與RS組比較，aP< 0.05， bP< 0.01; 與RS+CC組比較，cP< 0.05

4 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩提取物中黃芩苷的藥時(shí)曲線與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與灌胃給予黃芩苷純品一致。這表明黃芩自身成分對(duì)黃芩苷和漢黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué)特征沒有影響[17]。本研究中著重研究配伍對(duì)于瀉心湯中黃酮類成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。結(jié)果表明，黃芩伍用黃連后，黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Cmax1， Cmax2 和 AUC(0-∞))以及漢黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Cmax1 and AUC(0-∞))的數(shù)值顯著減少。該結(jié)果提示，配伍黃連使得兩者的生物利用度下降。黃連使黃芩苷和漢黃芩苷吸收減少的可能原因如下：

在黃酮類成分的吸收過程中，腸道菌群起著重要的作用，其活性直接影響著黃酮類成分的生物利用度。黃連的有效成分主要為小檗堿(berberine)，藥理研究表明，小檗堿有較強(qiáng)的抗菌作用[18]，故推測(cè)黃連的抗菌作用抑制了腸道菌群的活性，使黃芩苷水解成黃芩素減少，黃芩素跨膜減少，從而使黃芩苷吸收減少。

另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃連與黃芩復(fù)方煎出液可產(chǎn)生沉淀，且復(fù)方煎出液中黃連生物堿和黃芩中黃酮化合物的含量均有不同程度下降。產(chǎn)生沉淀的原因是由于黃連中含有原小檗堿型生物堿為堿性化合物與黃芩中含有多酚類化合物黃芩苷等酸性化合物相互結(jié)合，生成分子量較大的水不溶物[19]。有研究表明[20]，瀉心湯煎煮過程中產(chǎn)生的沉淀物在人工胃液和腸液中只能部分解離，釋放出活性成分黃芩苷和小檗堿。因此大鼠灌胃瀉心湯后，在腸道中很有可能存在未溶解的沉淀物，使黃芩苷吸收減少。

本研究結(jié)果還表明，大黃也可使黃芩苷吸收減少，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究闡明。