作者：鄭倩 劉紅 曹弟勇 劉華 藍(lán)海濤 敬華娥

【摘要】 目的通過白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）損傷離體胰島細(xì)胞，研究蟲草菌絲( Cordyceps sinensis， CS)含藥血清對胰島細(xì)胞的保護作用以及其機制與抗氧化酶和一氧化氮（Nitric oxide ，NO）的關(guān)系。方法離體培養(yǎng)乳鼠胰島細(xì)胞，用IL-1β?lián)p傷胰島細(xì)胞，與不同濃度CS含藥血清共同孵育，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活性，放免法檢測基礎(chǔ)和高糖胰島素分泌量，比色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮（NO）的含量，誘生型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase ，iNOS）、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione perioxidase，GSH-Px）的活性。結(jié)果CS含藥血清顯著提高IL-1β?lián)p傷的胰島細(xì)胞活性，并且胰島細(xì)胞基礎(chǔ)和高糖刺激胰島素分泌量明顯提高。IL-1β作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NOS活性升高，NO含量增加，而SOD，GSH-Px的活性水平降低，經(jīng)與不同濃度CS含藥血清共同孵育后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量減少、iNOS活性降低，SOD，GSH-Px的水平明顯升高，呈劑量依賴性，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論CS含藥血清對IL-1β?lián)p傷的胰島細(xì)胞分泌功能和細(xì)胞活性有保護作用，其機制與降低iNOS的活性，從而減少NO生成以及提高SOD，GSH-PX的活性水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 蟲草菌絲 血清藥理學(xué) 胰島 細(xì)胞損傷 細(xì)胞保護

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of medicated sera of cs on the islet cell damage induced by IL-1β.MethodsThe pancreases of the rats were removed to collect islet cells ，and then the cells were pided into normal control group， IL-1β damadaged group， IL-1β+medicated sera of cs groups.The cellular activity was detected with methyl-thiazol-tetrazolium(MTT) assay，basic amount of insulin secretion and stimulated by high glucose was detected by radioimmunoassay，the content of nitric oxide and activities of nitric oxide synthase superoxide dismutase and glutathione perioxidase were determued according to the kit direction.ResultsMedicated sera of cs obviously improved the islet cellular activity damaged by IL-1β，and basic amount of insulin secretion and stimulated by high glucose were improved（P＜0.01）. content of nitric oxide and activity of nitric oxide synthase in the supernatant were obviously higher in IL-1β damaged group，and there were significant differences between the medicated sera of cs groups and IL-1β damaged group. Compared with IL-1β damage group， medicated sera of cs could significantly elevate the activities of superoxide dismutase and glutathione perioxidase（P＜0.05 ，P＜0.01）.ConclusionMedicated sera of cs plays a protective role in the pancreatic islets damaged by IL-1β.The protective mechanism may be correlated with the decrease of iNOS activity and the content of nitric oxide，and the increase of the activities of superoxide dismutase and glutathione perioxidase.

Key wordsCordyceps sinensis； Seropharmacology； Islets of langerhans； Cytoprotction； Cell trauma 1型糖尿病是一種胰島β細(xì)胞選擇性破壞的自身免疫性疾病，其病理表現(xiàn)為大量免疫炎性細(xì)胞浸潤胰島，并分泌白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子，其中IL-1β可能是其重要的內(nèi)源性損傷因子［1］。近年來中草藥對糖尿病的防治作用受到了廣泛關(guān)注。冬蟲夏草是一種名貴強壯滋補中藥，為麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲上的子座及其幼蟲尸體的復(fù)合體。其味甘、性溫，歸肺、腎經(jīng)，有補虛填精、保肺益腎、止血化痰等作用，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抑菌、抗病毒的作用。但由于天然蟲草有嚴(yán)格的寄生性和特殊的生長地理環(huán)境，藥缺價高，限制天然蟲草的使用。人工蟲草是人工發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲，其成分和藥理作用與天然蟲草基本一致，因此對蟲草菌絲的實驗研究和臨床應(yīng)用逐步深入，有報道認(rèn)為蟲草菌絲可以降低血糖的濃度［2］，以及提高肝纖維化大鼠的胰島細(xì)胞基礎(chǔ)胰島分泌量［3］，但其具體機制并不清楚，缺乏相關(guān)的基礎(chǔ)研究。目前有報道認(rèn)為胰島抗氧化系統(tǒng)活性降低與一氧化氮（NO）水平提高是糖尿病早期病變之一，NO和氧自由基可破壞胰島細(xì)胞，引起1型糖尿病。本實驗室用IL-1β?lián)p傷乳鼠胰島細(xì)胞，觀察IL-1β對胰島抗氧化系統(tǒng)活性與NO 水平的影響，采用血清藥理的方法探討蟲草菌絲對IL-1β?lián)p傷的離體胰島細(xì)胞的活性和分泌功能是否具有保護作用以及其機制與抗氧化作用和NO的關(guān)系。

1 器材

1.1 材料出生1~3 d的Wistar大鼠 和體重200～220 g的健康Wistar大鼠均由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供；RPMI-1640培養(yǎng)液為美國GIBCO公司產(chǎn)品；IL-1β、胎牛血清為天津灝洋生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；蟲草菌絲購自中美華東醫(yī)藥制藥公司(批號061140)；胰島素放免檢測試劑盒為華西生物制劑公司產(chǎn)品；膠原酶V型、STZ均為美國Sigma公司產(chǎn)品；SOD，GSH-Px，NO，NOS 測定盒由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器CO2孵育箱（Forma scientific，美國），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰），倒置相差顯微鏡（olympus，日本），全自動酶標(biāo)儀（BIO-RAD，2550型，美國），紫外分光儀（RF-540，日本島津），臺式冷凍高速離心機（日立himac CF-15型，日本），高壓蒸氣滅菌器（YXQ-SG46，上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 藥物血清的制備 ① 選用Wistar大鼠40只，體重200~220 g，雌雄各半。灌胃前禁食12 h，設(shè)立正常對照組和用藥組，用藥組給予蟲草菌絲灌胃，每次10 ml/ kg，分低、中、高3個劑量組（1，10，20 g/kg），分別相當(dāng)于70 kg成人用量的5，10，20倍，正常對照組給予等容量生理鹽水灌胃，所取血清為生理鹽水對照血清 ，作對照用。② 使用二次加強給藥法給藥（首次給藥2 h后，再次予相同的劑量灌胃），在第2次給藥后第1，2，3 h，于無菌條件下自心臟采血，靜置4 h以上，離心30 min(3 000 r/min，4℃)，分離血清，56℃ ，滅活30 min，置-70℃ 低溫冰箱冷藏備用，1 個月內(nèi)使用。

2.2 胰島細(xì)胞分離與培養(yǎng)出生1~3 d的Wistar大鼠20只，無菌取出胰腺，清洗，剪碎，V型膠原酶消化，HankS液終止消化，消化離心。加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，去除成纖維細(xì)胞，收集胰島細(xì)胞，制成新的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106 ml，置96孔板培養(yǎng)，每孔內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μl。隨機分組。分為正常對照組、IL-1β?lián)p傷組、IL-1β+不同濃度CS含藥血清保護組（IL-Iβ+CS1為低劑量含藥血清組，IL-1β+CS2為中劑量含藥血清組，IL-1β+CS3為高劑量含藥血清組），每組平行孔6孔，損傷組和保護組每孔細(xì)胞加100 u/ml IL-Iβ 20 μl作用20 h后，正常對照組加入大鼠生理鹽水對照組血清20 μl，于不同保護組分別加入20 μl 低、中和高劑量含藥血清CS繼續(xù)培養(yǎng)30 h，進行各項檢測。

2.3 四唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測細(xì)胞活性檢測方法如下：將各組細(xì)胞離心（500 r/min×5 min），吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于細(xì)胞中加200 μl的培養(yǎng)液（不含胎牛血清）和5mg/ml的MTT 20 μl，放入CO2孵育箱培養(yǎng)4 h后，再離心（1 000 r/min×10 min），棄上清，加入二甲亞楓200 μl，振蕩5 min，在全自動酶標(biāo)儀上比色，測出每孔光密度值（OD值）進行比較，檢測波長為600 nm，OD值越高表明細(xì)胞活性就越強。

2.4 胰島細(xì)胞上清液胰島素分泌量測定提取正常對照組、IL-1β?lián)p傷組和IL-1β+CS組各待測標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用放免法檢測胰島素的基礎(chǔ)分泌量；在抽取上清液的各組細(xì)胞中加入含20 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，離心提取上清液，按上述方法進行高糖刺激胰島素分泌量檢測。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液NO水平，iNOS，SOD和GSH-Px活性的檢測提取正常對照組、IL-1β?lián)p傷組和IL-1β+CS組各待測標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別用試劑盒進行檢測，步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進行。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以±s表示，α=0.05，采用方差分析。整個統(tǒng)計資料采用SAS軟件處理完成。

3 結(jié)果

3.1 CS藥物血清對IL-1β?lián)p傷胰島細(xì)胞活性影響表1結(jié)果表明IL-1β?lián)p傷組與正常對照組比較光密度值OD值降低，表明細(xì)胞活性明顯下降（P＜0.01）；損傷后加入不同濃度CS藥物血清共同孵育可使OD值較損傷組均有不同程度的提高，具有顯著意義，且具有劑量依賴性。

表1 不同濃度CS藥物血清對IL-1β?lián)p傷細(xì)胞活性的影響（略）

與空白組比較，﹡﹡P＜0.01；與IL-1β?lián)p傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)液胰島素分泌量測定結(jié)果見表2。加入IL-1β作用后胰島細(xì)胞基礎(chǔ)分泌胰島素量和葡萄糖刺激分泌量顯著下降（P＜0.01），在損傷的基礎(chǔ)上與不同濃度CS藥物血清共同培養(yǎng)30 h后，測試培養(yǎng)液中分泌量和葡萄糖刺激胰島素分泌量較損傷組有明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)液基礎(chǔ)胰島素分泌量和葡萄糖刺激胰島素分泌量（略）

與正常對照組比較，﹡﹡P＜0.01; 與IL-1β?lián)p傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中 SOD，GSH-Px水平的測定與IL-1β作用后胰島細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性顯著降低（P＜0.01），GSH-Px活性減弱（P＜0.01），在損傷的基礎(chǔ)上與不同濃度CS藥物血清共同培養(yǎng)30 h后，測試培養(yǎng)液中SOD以及GSH-Px的活性升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量和iNOS活性的檢測加入IL-1β后，與正常對照組比較可見胰島細(xì)胞培養(yǎng)液中iNOS的活性與NO含量顯著增加（P＜0.01），經(jīng)與不同濃度CS藥物血清共同培養(yǎng)30 h后，測試培養(yǎng)液中iNOS的活性降低，NO 的含量減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表3 細(xì)胞培養(yǎng)液SOD和GSH-PX活性（略）

與正常對照組比較，﹡﹡P＜0.01；與IL-1β?lián)p傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;n=6

表4 細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量和iNOS活性（略）

與正常對照組比較，﹡﹡P＜0.01；與IL-1β?lián)p傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6 4 討論 血清藥理學(xué)研究是指給動物灌胃或人服用一定量的中藥或復(fù)方制劑，在一定時間后采集血液，分離血清，以此進行體外試驗的一種實驗方法。此方法由20世紀(jì)中期日本學(xué)者Iwama H等提出。與傳統(tǒng)的將中藥粗提物直接加入反應(yīng)體系中的方法相比，它具有明顯的優(yōu)勢：在某種程度上克服了中藥本身的雜質(zhì)對試驗結(jié)果的影響，而且相對接近于藥物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的真實過程，能客觀地闡明中藥藥效和作用機理，且使中藥藥理的研究易于深入到細(xì)胞分子水平。近20 年來，其已成為中藥藥理研究的一個熱點，在體外實驗中得到了廣泛的應(yīng)用，是目前研究中藥藥理學(xué)的一種較為理想的方法［4］。本研究采用血清藥理方法探討CS對IL-1β?lián)p傷胰島細(xì)胞的保護作用和機制，實驗中多次給藥可使血清藥物濃度出現(xiàn)累加效應(yīng)，二次重復(fù)給藥提高了血清藥物濃度，所采集的血清經(jīng)56℃ ，滅活30 min處理后，避免了未滅活血清中某些物質(zhì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性和不良反應(yīng)。 本實驗表明IL-1β對胰島細(xì)胞具有損傷作用，表現(xiàn)在100 u/ml的IL-1β使胰島細(xì)胞活性減弱，并且可抑制胰島分泌功能，使胰島素基礎(chǔ)分泌量和葡萄糖刺激胰島素的分泌量均減少，這與 Ohara-Imaizumi M［5］報道IL-1β可抑制胰島β細(xì)胞活性以及胰島素釋放等生物作用相似。經(jīng)與含CS含藥血清作用后，能反轉(zhuǎn) IL-1β 損傷的離體胰島細(xì)胞的活性，細(xì)胞活性與未加保護劑的損傷組比較均有顯著提高；并且能減輕IL-1β 損傷的胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌，使胰島分泌功能增強。 有報道認(rèn)為，細(xì)胞因子對胰島細(xì)胞的損傷與NO生成增多和SOD，GSH-Px表達(dá)異常有關(guān)［6］。本實驗亦證明IL-1β作用后胰島細(xì)胞SOD，GSH-Px活力明顯降低， SOD是機體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O-2·）保護細(xì)胞免受損傷，其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。自由基增多可對細(xì)胞、組織造成廣泛損害，自由基可通過丙二醛等醛類的促交聯(lián)特點失活蛋白質(zhì)；可以破壞細(xì)胞內(nèi)一些重要的酶類以及和β細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸反應(yīng)，降低胞膜流動性，增加通透性，導(dǎo)致線粒體腫脹、DNA斷鏈、降解，直接導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷。 Robertson RP［7］認(rèn)為胰島細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的含量和活性較低，極易受到氧自由基的損害，對抗氧自由基損傷可以提高胰島細(xì)胞的功能，是治療糖尿病的有效途徑之一。 本實驗中證實CS含藥血清反轉(zhuǎn)IL-1β?lián)p傷胰島細(xì)胞SOD，GSH-Px活性，可通過增強抗氧化酶的作用，提高清除體內(nèi)產(chǎn)生自由基的能力，從而減輕自由基的損傷，保護胰島細(xì)胞。CS其抗氧化作用可能與主要有效成分蟲草素有關(guān)，蟲草素含腺苷、腺嘌呤、尿嘌呤以及18種氨基酸等。 NO可能是IL-1β介導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷的另一效應(yīng)因子，有人認(rèn)為NO可能是通過降低線粒體內(nèi)烏頭酸酶的活性和抑制電子傳遞系的功能使細(xì)胞內(nèi)ATP生成減少以及DNA斷裂等因素，最終導(dǎo)致胰島細(xì)胞的損傷。體內(nèi)的NO是L-精氨酸在NOS催化下生成的，現(xiàn)在已經(jīng)鑒定出胰島細(xì)胞內(nèi)至少存在兩種NO合酶，一種是結(jié)構(gòu)性一氧化氮合酶（cNOS），另一種是有誘生性一氧化氮合酶（iNOS），cNOS釋放較低水平的NO，其作用介導(dǎo)不同的生理效應(yīng)，而在細(xì)胞因子介導(dǎo)下，iNOS表達(dá)產(chǎn)生大量的NO，導(dǎo)致胰島細(xì)胞的損傷。本實驗結(jié)果顯示，IL-1β組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中iNOS活性明顯升高，正是由于其活性的增強，從而使NO生成量增加，經(jīng)NO的細(xì)胞毒性造成胰島細(xì)胞的損傷。CS含藥血清與IL-1β?lián)p傷細(xì)胞共同孵育后，胰島細(xì)胞培養(yǎng)上清液中iNOS活性降低，NO的生成減少，結(jié)果提示CS可通過降低iNOS的活性而抑制NO的生成，減輕NO的毒性作用，從而保護胰島細(xì)胞。 本實驗表明CS藥物血清對胰島細(xì)胞具有保護作用，其機制與增強SOD和GSH-Px的活性以及降低iNOS的活性，減少NO的生成有關(guān)，本研究為尋找1型糖尿病的中藥治療打下了理論基礎(chǔ)，同時為1型糖尿病的治療提供新的思路與臨床用藥篩選。我國的中醫(yī)藥要走向世界需廣大科研工作者對中藥藥理機制進行全面而深入的研究。由于中藥含藥血清的制備過程中受到動物選擇、給藥劑量、采血時間以及含藥血清的滅活、除菌、保存等諸多因素的影響，血清中所含的確切藥效成分尚未十分明了，其方法在技術(shù)上尚需探討、規(guī)范和完善，因此研究CS中藥血清對體外胰島細(xì)胞的藥理作用還有待多方面驗證。 致謝：本院藥物研究所張翔老師和袁彬老師給予了極大的支持與幫助，特此致謝！

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