【摘要】 目的用利福平、異煙肼藥物作用 H37Rv 株，誘導基因突變，用基因芯片技術檢測耐藥菌株突變基因位點。 方法 H37Rv 菌株用不同濃度的利福平和異煙肼加入培養液中觀察菌株的耐藥生長情況，耐藥菌株用 PCR 擴增產物雜交，基因芯片檢測藥物作用部位是否有突變，檢測突變基因位點。 結果利福平藥物誘導H37Rv耐藥，用基因芯片技術檢測利福平耐藥菌株，rpoB 基因 531 位發生突變，TCG 轉變為 TTG，直接測序發現在相同 位點發生突變。耐異煙肼耐藥菌株 katG 基因 315 位發生突變，AGC 轉變為 ACC。同時加入兩種藥物的耐藥株用基因芯片檢測分別在 rpoB 基因 531位，katG 基因 315 位發生突變。結論結核分枝桿菌產生耐藥的機理與藥物作用基因位點突變有關?；蛐酒瑱z測技術耐藥菌株基因突變，不僅可以準確地確定突變位點和突變類型，快速、高效、設備簡單，并能同時檢測分析成千上萬個基因有關突變位點。

【關鍵詞】 H37Rv 株；藥物誘導耐藥；DNA 芯片；突變基因

我國是世界上結核病發病率最高的 22 個國家之一，肺結核患者約有 600 萬人，每年約有 25 萬人死亡。世界衛生組織報警：肺結核日奪全球千人性命，在西太平洋地區每日有近 1 000 人死于肺結核，將削弱地區的經濟增長，肺結核大部分患者年齡在 15 歲至 54 歲之間，是社會的主要勞動力。如果作為家庭經濟支柱，經濟有重要影響，在孟加拉國每 2 min 就有 1 人感染肺結核，每 10 min 就有 1 人死于結核病。結核病嚴重危害人類健康及經濟的發展。結核病流行顯示高患病率、高耐藥率、低速降率等特點[1]，特別是抗結核藥物的廣泛應用及不合理的服藥，結核桿菌產生高耐藥，臨床檢測困難，耐藥菌株存在作為傳染源，對流行病的控制帶來嚴重威脅?？焖贆z測那部分耐藥菌株，可為臨床診斷治療提供可靠的依據。為了消除傳染源，控制結核病的流行，我們用利福平等藥物作用于結核菌，用基因芯片技術檢測耐藥菌株的基因變化，有快速高效的應用效果，現報道如下。

1材料和方法

1.1材料和儀器

1.1.1全自動血培養儀Esp c lture systemⅡ。

1.1.2結核菌培養液Esp myco 培養瓶，12.5 mL/ 瓶，美國 TREK Diagnostic systems Inc 生產。

1.1.3生物安全柜Fx1200-Ⅱ-A/B，上海瑞仰凈化設備有限公司。

1.1.4煮沸箱。

1.1.5Lightcycler 熒光 PCR 儀。

1.1.6Generalscanning 芯片信息系統 Scannarray 3000 掃描儀。

1.1.7基因芯片由中科院上海信息系統和微技術研究所，寧波瑞芯生物科技有限公司生產。

1.1.8引物正向 CAG GAC GTG GAG GCG ATC 18 bp；反向 C GCT CAC GTG ACA GAC CG 18 bp；由上海生工工程技術服務有限公司合成。

1.1.9 H37Rv 菌株購自中國藥品生物制品檢定所

1.1.10利福平﹑異煙肼醫院購買。

1.2方法

用利福平﹑異煙肼藥物誘導作用 H37Rv 菌株。

1.2.1H37Rv 菌株在無菌生物柜中打開，用無菌生理鹽水稀釋，抽取 0.5 mL 接種。Esp myco 培養基中置 Esp culture system Ⅱ 培養儀培養，3 周后見細菌生長，繼續培養 1 周后取培養液 0.5 mL 分別接種于 Esp myco 培養基中，置培養儀培養，培養 2 周后見各瓶有細菌生長。

1.2.2用利福平加入培養懸液中誘導作用于細菌。利福平 0.15 g/粒，用無菌生理鹽水 10 mL 溶解呈 150 mg/10 mL，抽取 1 mL=15 mg/mL 利福平加 9 mL 生理鹽水，即呈 1.5 mg/mL，即 1 500 g/mL 利福平。

1.2.3取 1 500 g/mL 利福平 2 mL 加入培養液中，濃度呈 240 g/mL 利福平。取 1 500 g/mL 利福平 0.4 mL 加入培養液中，濃度呈 48 g/mL 利福平。取 1 500 g/mL 利福平 0.4 mL 加入培養液中，濃度呈 4.8 g/mL 利福平。依據 WHO 公布的標準：細菌在含 40~50 g/mL 利福平培養基上可以生長為耐藥。

1.2.4用異煙肼加入培養懸液中作用誘導細菌異煙肼 100 mg/ 片，溶于 10 mL 無菌生理鹽水中即 100 mg/10 mL；取 1 mL 加水 9 mL 稀釋濃度呈10 mg/10 mL；取1 mL 加水 9 mL 稀釋濃度呈 1 mg/10 mL，即 1 000 g/10 mL，100 g/mL；取 1 mL 加水 9 mL 稀釋濃度呈 10 g/mL；取 1.4 mL 10 g/mL 利福平加入培養基菌液中呈 1 g/mL 異煙肼濃度。取 1.4 mL 100 g/mL 利福平加入培養基菌液中呈 10 g/mL 異煙肼濃度。取 0.7 mL 100 g/mL 利福平加入培養基菌液中呈 5 g/mL 異煙肼濃度。耐藥標準 1~10 g 異煙肼在培養基上仍能生長。

1.2.5培養基懸液中分別加入含 5 g/mL 異煙肼，48 g/mL 利福平的培養基懸液；配制成含 10 g/mL 異煙肼，248 g/mL 利福平的培養基懸液作用誘導細菌。

以上 1.2.3，1.2.4，1.2.5 配制含不同藥物的培養基置培養儀培養觀察結果。

1.2.6培養物含不同藥物濃度經 70 d 后仍能生長的細菌培養液。分別取耐 48 g/mL 利福平﹑5 g/mL 異煙肼﹑48 g/mL 利福平和 5 g/mL 異煙肼菌液作測定。據有關文獻報道，異煙肼耐藥標準 1 g/mL 和 10 g/mL 分別為低濃度和高濃度耐藥[2]，WHO 公布的標準細菌在含 40~50 g/mL 利福平培養基上可以生長判定為耐藥。H37Rv 原菌培養液作對照。用煮沸裂解法提取 DNA，將抽提液用聚合酶鏈反應擴增所需目的 DNA 片段。引物由上海生工生物工程服務公司合成，rpoB 基因引物：上游引物 5＇-CAG GAC GTG GAG GCG ATC-3＇下游引物：5＇-C GCT CAC GTG ACA GAC CG-3＇，序列號 515684，rpoB 基因 794-1974，目前國際國內研究突變基因相關區域。katG 基因引物 1.5＇-CAC TTT CGG TAA GAC CCA TGG C-3＇，2.5＇-TAT TGC CAA GCG CCA GCA GG-3＇。rpoB 基因，聚合酶鏈反應程序，擴增體系 25 L，取制備好的 DNA 樣品 2 L，PCR 反應液 Buffer 3 L，dntp 2.5 mmol/L 2 L，Taq 聚合酶 2 L，Mg2+ 2.5 mmol/L 2 L，10pmmol/mL，引物 1、2 各 0.75 L。加水 12.5 L。聚合酶鏈反應程序：首先將標本預變性 94℃ 4 min，再以 94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s 循環 35 次。再后 72℃ 延伸 4 min，置 2~8℃ 保存。KatG 反應體系：50 L。Buffer 5 L；2 mmol/L MgCl 4 L；dntp 5 L；引物 1 20 mol/L 1 L；引物 2 20 mol/L 1 L；Tap 聚合酶 5 g/l 0.4 L；模板 5 L；H2O 28.6 L。反應程序：首先 94℃ 3 min 預變性，然后以 94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環，再后以 72℃ 5 min 延伸，置 2~8℃ 保存。

1.2.7聚合酶鏈擴增產物由中科院上海信息系統和微技術研究所寧波瑞芯生物制品有限公司用基因芯片技術進行基因測序及基因突變分析。 H37Rv 對照樣本及耐藥菌株的擴增產物，用基因芯片序列測定。該芯片包括：511，513，514，516，526，531，532 和 533 位密碼子突變在內的 30 種單核苷酸變態性。還包括 katG 基因 282~387 位密碼子。

2實驗結果

2.1培養結果觀察

含異煙肼 5 g/mL 培養基在 35 d，70 d 仍見細 菌生長。含利福平 48 g/mL 培養基在 21 d，35 d，70 d 仍見細菌生長。含利福平 48 g/mL 和異煙肼 5 g/mL 培養基在 21 d，35 d，70 d 仍見細菌生長。

2.2基因芯片檢測結果

2.2.1H37Rv 株基因芯片測序及直接測序為野生型。

2.2.2H37Rv 利福平耐藥株基因芯片檢測發現531 位基因發生突變。TCG 突變為 TTG。

2.2.3利福平加異煙肼作用 H37Rv 株耐藥發現531 位、315 位均發生突變。TCG 突變為 TTG AGC 突變為 ACC。

2.3直接測序結果

2.3.1H37Rv 株用測序儀直接測序未見突變基因。

2.3.2利福平作用 H37Rv 株見 531 位發生突變。TCG 突變為 TTG。

2.3.3異煙肼作用 H37Rv 株見 315 位發生突變。AGC 突變為 ACC。

3討論

抗結核藥物的誕生拯救了無數結核病患者的生命，對結核流行病的控制發揮了巨大作用。但隨著藥物的濫用及不正規使用，結核菌應對環境的生存條件，對一些藥物產生耐藥，無論細胞膜或細胞核都會發生變異。菌株能變異成顆粒狀，抗酸性陰性或減弱。研究發現 DNA 發生突變，是藥物作用部位的遺傳基因發生改變而產生耐藥。實驗用利福平誘導 H37Rv 株發現 DNA531 位堿基發生突變：TCG→TTG，產生耐藥，且仍具生命。利福平藥物的作用是通過細菌 DNA 聚合酶β亞基結合，抑制轉錄起始和 RNA 的延伸，起到殺菌作用。這個結合位點是由不同 RNA 聚合酶亞單位上關鍵氨基酸的改變而導致其構象的改變，從而使藥物結合位點缺失[3]。 rpoB 基因是細菌 RNA 聚合酶β亞基的編碼基因，全長 3 543 個堿基，現研究發現其中長 81 個堿基的核心區易發生突變，利福平不能與 RNA 聚合酶亞基結合因而細菌產生耐藥，這與 Garoial 等的結果相似[4]。我們的實驗結果發現 531 位發生突變與國外報道相符。

目前國內外研究證明 90%~95% 的結核分枝桿菌耐利福平菌株存在 rPOB 基因突變，而且這些突變集中于核心區域內包括 507~533 位是耐利福平的決定區。

異煙肼作用 H37Rv 株誘導結果發現 DNA315 位堿基發生突變。近年來國內外學者的大量研究認為異煙肼實際上是一藥物前體，需經 mtb 過氧化氫- 過氧化酶（katG）活化后才發揮抗結核作用，而過氧化氫-過氧化酶正是由 katG 基因編碼的[5]。在對耐INH 的臨床分離株中，3 株菌種有 2 株存在 katG 基因片段的缺失，他們認為 katG 基因的缺失是 mtb，INH 耐藥的共同機理[6]。國內吳雪瓊、胡忠義等研究證明 katG 基因突變在 315 位密碼子。目前，我國對 katG 基因的分析多集中于 282 bp 與 237 bp 突變區域，這些區域的變異可在 2/3 的耐藥菌株中觀察到[7]。實驗結果也顯示耐 INH H37Rv 株在 315 位密碼子有突變：AGC 突變為 ACC（絲氨酸突變為蘇氨酸）。katG 基因的突變，過氧化酶活性下降，異煙肼失去對細菌的殺滅作用。

我們用利福平和異煙肼兩種藥物作用 H37Rv 株培養誘導，菌株對兩種藥物均產生耐藥，用基因芯片測序，在 531 位和 315 位堿基均發生突變：TCG 突變為 TTG，AGC 突變為 ACC。這在國內外學者研究中也曾報道：結核分枝桿菌對多種藥物耐藥。這給臨床治療帶來了困難，提示臨床選用其他的藥物治療。

從我們的實驗中證明了國內外學者對結核分枝桿菌耐利福平、異煙肼藥物產生，rpoB 基因及 katG 基因突變的研究成果。結核分枝桿菌 rpoB 基因及katG 基因的改變因而產生對利福平及異煙肼耐藥。

基因芯片技術在 90 年代首先由美國 Affymetrix 公司的 Fodor 博士提出并開始基因芯片技術的研究，它是目前分子生物學最前沿的方法，是物理學、微電子學和生命科學的交叉綜合的高新技術，是近年來發展起來的進行大規模遺傳變態性檢測的新方法?；蛐酒夹g在結核分枝桿菌菌種鑒定中的應用，具有高速高效等優點，能同時分析成千上萬個基因，用基因芯片直接測序可在幾小時內測得結果。在結核分枝桿菌耐藥性研究中用芯片檢測結果突變型，測序結果也是突變型，而且病人痰液中存在少量的 DNA 就能夠進行結核分枝桿菌分子的突變，不僅可以正確地確定突變位點和突變類型，而且基因芯片技術能將大量探針同時固定在支持物上，可以一次性對樣品序列進行檢測和分析。所以可以利用芯片測序的技術來檢測患者標本中是否存在結核分枝桿菌，更重要的是它的快速、高效、設備簡單。既提高了檢測的特異性，又能將結核桿菌感染和其他分枝桿菌感染區分。因此，基因芯片技術可作為臨床檢測結核桿菌感染。何敏等檢測 102 例肺結核患者晨痰標本的結果用基因芯片技術檢測的陽性率要高于痰涂片法和痰培養法[8]。這一新技術在臨床推廣應用具有極大價值，芯片技術創始于 20 世紀 90 年代初，是目前分子生物學最前沿的方法[9]。我們利用基因芯片技術對 H37Rv 株用藥物作用誘導檢測基因突變，還未在臨床廣泛應用。下一步工作將用此技術應用于臨床，為臨床診斷治療提供新的方法。

【參考文獻】 〔1〕全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組， 全國結核病流行病學抽樣調查辦公室. 2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告〔J〕. 中國防癆雜志， 2002， 24:65-108 〔2〕吳雪瓊. PCR直接測序法分析結核分枝桿菌KatG基因突變〔J〕. 臨床檢驗雜志， 2000， 18:9-10 〔3〕李燕. 結核桿菌對利福平耐藥的分子機理的研究〔J〕. 四川省衛生管理干部學院學報， 2002， 21:1-2 〔4〕Garcia L， Alons Sanz M， Rebollob MJ， et al. Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tubercμLosis islotes in Spain and their rapid detection by PCR-enzyme-linked immunosorbent assay〔J〕. J Clin Microbiol， 2001， 39:1813-1818 〔5〕CAI Mer-ying. Mutation of hydrogen hyperoxide-hyperoxide gene encoded by isoniazid-resistant Mycobacetrium tubercμLosis strains〔J〕. Branch of Microbiology， Foreign Medical Science〔國外醫學（微生物學分冊）〕， 1995， 18(1):47-48(in Chinese) 〔6〕Zhang Y， Heym B， Allen B， et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tubercμLosis 〔J〕. Nature， 1992， 358N. 6387:591-595 〔7〕吳雪瓊， 莊玉輝， 張曉剛， 等. 結核分枝桿菌耐異煙肼分子機制的研究〔J〕. 中國防癆雜志， 1998， 20(1):35 〔8〕何敏. 利用基因芯片檢測結核分枝桿菌及其利福平耐藥性的研究〔J〕. 中華流行病學雜志， 2003， 24:385-388 〔9〕Cheung VG， Morley M， Aguilar F， et al. Making and reading microarrays〔J〕. Nat Genet， 1999， 21(1):15-19