作者：鄭鴻燕 邰浩清 ，曾水林

【摘要】 目的:觀察當歸補血湯對耳蝸干細胞移植治療感音神經性耳聾大鼠增效作用。方法:感音神經性耳聾大鼠分為耳蝸干細胞移植組、當歸補血湯組和空白對照組3組。體外培養耳蝸干細胞進行內耳移植，耳蝸干細胞移植組將耳蝸干細胞懸液移植入內耳耳蝸結構，當歸補血湯組將含有當歸補血湯的耳蝸干細胞懸液移植入內耳耳蝸結構，空白對照組移植生理鹽水。分別于術后1、3、6和12個月采用聽覺腦干誘發電位方法檢測模型大鼠的聽力恢復情況，處死大鼠，通過免疫熒光染色方法觀察移植的耳蝸干細胞在內耳存活、分化和遷移情況。結果:從E14大鼠耳蝸分離的組織，經原代和傳代培養后，可獲得大量未分化懸浮生長的Nestin陽性細胞團， Brdu表達陽性，說明是具有自我更新和增殖潛能的干細胞。免疫熒光檢測發現在耳蝸干細胞移植組、當歸補血湯組在移植針道兩側可見移植的干細胞，有些還遷移到基底膜區。存活的細胞部分呈 Myosin Ⅶ A陽性染色。與耳蝸干細胞移植組比較，當歸補血湯組 Myosin Ⅶ A陽性染色細胞數量較多，差異有統計學意義(P<0.05)。聽覺腦干誘發電位結果顯示當歸補血湯組的感音神經性耳聾模型大鼠聽力恢復情況較耳蝸干細胞移植組和對照組好，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：經體外培養的耳蝸干細胞移植入內耳鼓階后能夠存活和遷移，并分化為內耳毛細胞;當歸補血湯可以提高耳蝸干細胞分化為內耳毛細胞的比例，并促進感音神經性耳聾模型大鼠聽力恢復。

【關鍵詞】 耳蝸干細胞; 移植; 當歸補血湯; 大鼠

[Abstract] Object: To investigate the effect of astragalus membranaceus and angelica sinensis on implantation of stem cells from cochlea for management of hearing loss. Methods: The hearing loss model rats were pided into cochlea stem cells group， astragalus membranaceus and angelica sinensis group， control group. Cochlea stem cells were isolated and cultured by using serum free medium. Cochlea stem cells were grafted into the rats cochlea regions in cochlea stem cells group， both cochlea stem cells and astragalus membranaceus and angelica sinensis were grafted into the ratss cochlea regions in astragalus membranaceus and angelica sinensis group， and saline were grafted into the ratss cochlea regions in the control group. The hearing recovering of the hearing loss model rats were measured by brain stem auditory evoked protential on 1， 3， 6 and 12 months after implantation. Immunofluorescence was used to detect the results of stem cells survival， differentiation and migration. Results: The dissociated cells from the newborn rat organ of corti developed into much of indiffrentiated otopheres of nestin(+) cells when plated on a nonadherent substratum. Within cultured otospheres， Brdu(+) cells were rapidly risen to newly formed otopheres. Myosin ⅦA(+) hair cells were detected by immunofluorescence on both side of implantation area in cochlea stem cells group and astragalus membranaceus and ngelica sinensis group， some of Myosin ⅦA(+) hair cells migrated to basal membrane area. The number of Myosin ⅦA(+) hair cells was much more in astragalus membranaceus and angelica sinensis group than in other groups(P<0.05). The hearing recovering of the hearing loss was better in astragalus membranaceus and angelica sinensis group than in other groups(P<0.05). Conclusion: Cochlea stem cells could survive， differentiate and migrate after implantation into the hearing loss model rats. Astragalus membranaceus and angelica sinensis could increase the number of Myosin ⅦA(+) hair cells and accelerate hearing recovering of the hearing loss model rats.

[Key words] cochlea stem cells; implantation; astragalus membranaceus and angelica sinensis; rats

噪聲、抗生素和年齡引起的毛細胞壞死是聽力損傷的主要原因。傳統觀點認為毛細胞損傷后無法再生，相關組織也無法進行功能重建，所以這種聽力損害是永久性的。內耳毛細胞再生和修復一直是近年來聽力學研究領域關注的熱點。利用耳蝸神經干細胞移植技術，使變性壞死的內耳毛細胞再生，有可能成為治療耳聾的新手段。在以往的實驗中，我們對耳蝸部位進行了耳蝸干細胞的分離、培養和鑒定[1]，研究發現耳蝸干細胞經胎牛血清誘導分化后，可分化為內耳毛細胞和支持細胞，當歸補血湯可提高體外培養的耳蝸干細胞向內耳功能細胞的分化比例[2]。當歸補血湯是中藥傳統經典組方，實驗表明當歸補血湯能夠對血管內皮細胞[3]、脾樹突狀細胞[4]、造血祖細胞[5]等具有促進細胞增殖，并誘導其分化等影響。當歸補血湯是否會對移植耳蝸干細胞的增殖分化產生影響呢?本實驗對耳蝸干細胞培養后進行內耳移植，同時采用中藥當歸補血湯進行干預，通過聽覺腦干誘發電位方法檢測模型大鼠的聽力恢復情況，免疫熒光染色方法觀察移植的耳蝸干細胞在內耳存活、分化和遷移情況以及當歸補血湯對耳蝸干細胞增殖分化的影響，為進一步研究中藥干預耳蝸干細胞移植和定向分化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

1.1.1 實驗動物 E14大鼠由南京中醫藥大學動物室提供。

1.1.2 實驗試劑和抗體 Neurobasal培養基、B27輔助培養基(GIBCO公司)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Sigma公司)、胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)、多聚賴氨酸(Sigma公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、巢蛋白(Nestin)抗體、Brdu及其單克隆抗體(Sigma公司)、Myosin Ⅶ A抗體(Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器 離心機(Centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司)、超凈工作臺(凈化等級100級，吳江市凈化設備總廠)、恒溫水浴箱(SHAC，金壇市恒豐儀器廠)、倒置相差顯微鏡(OLYMPUSCK2，日本OLYMPUS公司)、熒光顯微鏡(BX60 F5，日本OLYMPUS公司)。

1.2 耳蝸干細胞取材、培養和鑒定

乙醚麻醉E14大鼠，取出內耳耳蝸。分離Corti器，HBSS液沖洗3次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37 ℃消化30 min。吸管輕柔吹打成單細胞懸液。以1×105 ml-1的細胞密度移入培養瓶中培養，每隔3 d半量置換培養基。培養7～9 d后，機械分離神經球進行傳代。具體操作方法見

1.3 當歸補血湯含藥血清制作

當歸補血湯配方比例為黃芪 ∶當歸=5 ∶1，藥物組大鼠在1～3 d早晚各給藥2 ml·(100 g)-1，第4天一次服用全天劑量，采血前禁食12 h，末次給藥2 h后采血。取血后分離血清，56 ℃滅活30 min，-20 ℃凍存備用。具體配制方法見

1.4 細胞核標記

移植前24 h，將Brdu溶于無血清培養基中，避光備用。吸干培養基，加入Brdu溶液，避光孵育60 min，用Hanks液沖洗去除未結合Brdu，熒光顯微鏡觀察。Brdu標記的是具有增殖特性的干細胞的細胞核。采用0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，調整密度至1.0×106 ml-1懸浮于1 ml無血清培養基中備用。

1.5 感音神經性耳聾模型建立

選擇聽力正常雄性健康大鼠，體質量180～200 g，耳廓反射陽性，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，未發現中耳炎。50 mg·kg-1硫酸慶大霉素腹腔注射，早晚各1次，每日檢測腦干聽覺誘發電位1次，以閾值下降30 dB的聽力損失為停藥指標。

1.6 耳蝸干細胞移植

將大鼠感音神經性耳聾模型分為3組，即耳蝸干細胞移植組、當歸補血湯組及對照組，每組40只大鼠。耳蝸干細胞移植組將耳蝸干細胞懸液移植入大鼠內耳耳蝸結構;當歸補血湯組將含有當歸補血湯的耳蝸干細胞懸液移植入大鼠內耳耳蝸結構;對照組大鼠移植生理鹽水。乙醚麻醉大鼠，耳蝸底周鼓階鉆孔，采用微推進器向鼓階外淋巴腔導入細胞，每只豚鼠只作右耳。取耳后切口，暴露聽泡骨質，打開聽泡，距圓窗龕約1.0 mm處耳蝸底周鼓階外側壁下方，磨一直徑約0.2 mm小孔，由鼓階造孔處緩緩注入10 μl細胞懸液或生理鹽水，注射速度0.5 μl·min-1。注射完畢留針5 min。注射完畢后，肌漿組織封堵造孔，逐層縫合皮膚切口。術前5 d至術后7 d皮下注射地塞米松和肌肉注射青霉素，以預防中耳感染。

1.7 腦干聽覺誘發電位測定

用誘發電位儀在隔音屏蔽室內測定清醒狀態下的大鼠腦干聽覺誘發電位。用固定裝置固定大鼠，引導電極置于顱頂部，參考電極及接地電極分別置于同側和對側乳突部。用短聲刺激，由聲刺激器輸入波寬為0.1 ms方波電脈沖，經EDL903型耳機輸出，10 次·s-1。放大器通頻帶為80～3 000 Hz，增益2 000，疊加200次，以Ⅳ波剛出現時的刺激強度PESPL值為腦干聽覺誘發電位反應閾值。

1.8 取材

移植后1、3、6和12個月每組隨機抽取10只大鼠，戊巴比妥納深度麻醉后開胸，經左心室插管至主動脈，快速灌注生理鹽水150 ml，后用4%多聚甲醛灌注固定，取耳蝸，后固定24 h用于冰凍切片。取材后處理：將耳蝸組織取出移入30%蔗糖溶液中，4 ℃浸泡24 h以上，直至耳蝸組織沉底。將耳蝸組織用OCT包埋劑包埋后-20℃下保存備用。置OCT包埋耳蝸組織于冰凍切片機載物臺上，行冰凍切片，片厚30 μm，切片置于PBS中漂洗。

1.9 免疫熒光染色

Nestin免疫熒光染色鑒定耳蝸干細胞，Brdu免疫熒光染色檢測具有增殖特性的耳蝸干細胞的細胞核，Myosin Ⅶ A免疫熒光染色檢測早期分化的毛細胞，熒光顯微鏡觀察并攝片。顯微鏡下觀察5個視野取平均值，計數Brdu陽性細胞、耳蝸干細胞、毛細胞的數量。

1.10 統計學處理

實驗數據以±s表示，兩組間均值的比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 E14大鼠耳蝸干細胞的培養和鑒定

剛分離的單細胞鏡下呈圓形，大小不一，無突起長出。5～6 d后可見大量懸浮的細胞團形成，原代的細胞球經胰酶消化后繼續傳代培養又可形成新的細胞球(圖1、2)。這些細胞球經Nestin免疫熒光鑒定呈陽性反應，表明是具有自我更新能力的干細胞。

2.2 聽覺腦干誘發電位檢測

術后1、3、6和12個月各組模型大鼠聽覺腦干誘發電位結果顯示，與耳蝸干細胞移植組相比，當歸補血湯組聽覺腦干誘發電位閾值較高，差異有統計學意義(P<0.05)。兩個實驗組和對照組比較，腦干誘發電位闕值均顯著升高(P<0.05)。見表1。表1 各組術后聽覺腦干誘發電位閾值比較

2.3 免疫熒光檢測

2.3.1 Nestin免疫熒光檢測 Nestin免疫熒光鑒定檢測到陽性細胞球，證明實驗中培養的細胞是耳蝸干細胞(圖3)。熒光顯微鏡下Brdu標記細胞呈綠色單核細胞，說明培養的是具有增殖特性的干細胞(圖4)。耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯組耳蝸標本移植后1個月和3個月沿移植針道分布大量綠色熒光信號，集中在鼓階，前庭階和膜蝸管少。切片中還可見呈散點狀分布的綠色熒光信號。綠色熒光顯示的是Nestin(+)的耳蝸干細胞，細胞呈圓形，體積大小不等，在局部區域還可見兩三個細胞聚集在一起形成的細胞團，少數細胞可從神經球體中遷移出來，細胞形態不規則(圖5)。空白對照組切片中可見強度微弱的散在熒光。細胞計數結果顯示，當歸補血湯組的Nestin(+)細胞數量較耳蝸干細胞移植組多，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯組移植后6個月和12個月Nestin免疫熒光鑒定結果發現沿移植針道分布微弱的綠色熒光信號，但數量較移植1個月和3個月的少，而且距離移植針道位置稍遠。

2.3.2 Myosin Ⅶ A免疫熒光檢測 感音神經性耳聾模型大鼠內耳毛細胞排列欠整齊，出現毛細胞排列稀疏倒伏等情況(圖6)。耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯組移植后6個月和12個月Myosin Ⅶ A免疫熒光鑒定結果顯示，沿移植針道周圍分布紅色熒光信號;Brdu免疫熒光鑒定切片中仍可見呈散點狀分布的綠色熒光信號，但較弱;在距離移植針道位置稍遠處，Myosin Ⅶ A(+)細胞呈現良好的分布，有向基底膜和柯蒂氏器遷移行為，陽性細胞突起較短，生長狀況較好。也有的細胞位置不確定，但是從遷移的細胞數量上來看，當歸補血湯組的Myosin Ⅶ A(+)細胞數量較耳蝸干細胞移植組多，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。對照組移植針道周圍呈較弱的熒光信號。表2 Nestin(+)細胞和Myosin ⅦA(+)細胞數量檢測個

3 討 論

噪聲、抗生素和激光等人為刺激可致在體和離體組織塊內耳毛細胞創傷，因為毛細胞的壞死變性是不可逆的，所以耳聾疾病在臨床上幾乎沒有治愈的可能。對毛細胞的再生和功能重建研究，是近年來聽力學研究的熱門課題[6-8]。

胚胎干細胞的發現使人們想到如果把這種細胞移植入相應的動物模型體內，修補或替代壞死的組織細胞，就可以達到治療臨床疾病的目的。自我更新和高度增殖的特性將有可能使衰老的肌肉、病態的心臟和遲鈍的大腦重新恢復健康。目前人類干細胞如胚胎干細胞、造血干細胞、神經干細胞和骨髓間充質干細胞已成為生物科學技術領域中最有希望和最有吸引力的研究熱點。近年來，隨著現代醫學的發展，基因治療和干細胞移植治療已成為各類疾病的主要治療手段[9-11]。

實驗發現將體外培養的神經干細胞移植入內耳耳蝸后，在移植組織內有向毛細胞轉化的趨勢[12-14]。因此，干細胞內耳移植后分化為內耳毛細胞可能是毛細胞再生的方法。我們在無菌條件下對內耳進行取材，取出耳蝸后進行細胞培養，培養后的細胞經Nestin免疫熒光鑒定呈陽性反應，Brdu鑒定陽性的細胞是具有增殖潛能的耳蝸干細胞的細胞核。感音神經性耳聾大鼠模型制作成功后，將培養的耳蝸干細胞移植到模型大鼠內耳鼓階，術后1、3、6和12個月各組模型大鼠聽覺腦干誘發電位測定結果顯示，耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯組感音神經性耳聾模型大鼠的聽力功能隨著移植時間的延長有所改善，尤其是當歸補血湯組大鼠的聽力恢復更佳。說明移植到大鼠內耳的耳蝸干細胞不但可以存活，而且會隨著時間的推移逐漸分化為內耳功能細胞即毛細胞，并且這種毛細胞會逐漸向損傷區域遷移，替代壞死的毛細胞，使大鼠的聽力功能得到恢復。但這種功能恢復是否會持久，完全取決于移植分化的毛細胞是否在宿主體內能夠長期存活并遷移至損傷部位，與聽神經元建立突觸連接，以上問題還需要長期的實驗觀察，也將是我們下一步的研究方向。

移植后1個月和3個月耳蝸標本免疫熒光染色結果顯示，耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯組沿移植針道分布大量綠色熒光信號，細胞呈圓形，體積大小不等，在局部區域還可見細胞團，少數細胞可從細胞球中遷移出來，細胞形態不規則，集中在鼓階，前庭階和膜蝸管少。綠色熒光是Nestin(+)的耳蝸干細胞，說明我們移植的的確是耳蝸干細胞，而且細胞形態也符合干細胞的特性。隨著時間的推移，耳蝸干細胞有向神經球外遷移的跡象，而且在移植環境刺激因素的作用下可能分化為其它細胞。這進一步說明實驗移植的的確是耳蝸干細胞，而且耳蝸干細胞會在宿主體內存活，但位置仍大多分布在針道周圍，個別細胞發生遷移，但遷移速度較慢。而移植后6個月和12個月耳蝸標本Nestin免疫熒光鑒定結果發現，沿移植針道分布微弱的綠色熒光信號，說明耳蝸干細胞在移植宿主體內隨著時間的推移會發生分化。實驗發現Myosin ⅦA(+)細胞呈現良好的分布，有向基底膜和柯蒂氏器遷移行為，生長狀況較好，說明隨著時間的延長，移植的耳蝸干細胞會分化為內耳毛細胞，分化的毛細胞會繼續發生遷移，遷移至離針道較遠區域。Brdu免疫熒光鑒定顯示切片中仍可見呈散點狀分布的綠色熒光信號，但數量較移植后1個月和3個月的少，而且距離移植針道位置稍遠。這說明Brdu在移植宿主體內隨著時間的延長會發生衰減，在分化的細胞中Brdu含量較少。

當歸補血湯是臨床內科應用最廣泛的中藥之一，用于心腦血管疾病和血液系統疾病的治療[15-16]。本實驗結果發現，與耳蝸干細胞移植組比較，當歸補血湯組移植后1個月和3個月Nestin(+)細胞數量增多，移植后6個月和12個月Myosin ⅦA(+)細胞數量也增多，說明當歸補血湯還可以促進移植的耳蝸干細胞在移植組織內的存活和分化，提高移植的耳蝸干細胞向功能細胞的分化比例。

研究表明多種營養因子在聽覺功能細胞的發育、存活和生理功能維持中起到重要作用[17-19]。我們推測一方面當歸補血湯中除神經鞘磷酯、神經節苷酯、神經酰胺等營養物質外，可能還含有多種營養因子，使移植的耳蝸干細胞向早期毛細胞分化數量增多，提高了向功能細胞分化的比例。另外一方面移植實驗中組織的處理、動物麻醉、機械損傷或胰酶消化、缺血缺氧、局部損傷、血供缺乏等會造成移植宿主組織局部缺血缺氧，當歸注射液減弱了缺氧刺激引起的神經干細胞的壞死和凋亡，提示當歸對缺氧可能有保護作用。拆方研究表明，當歸或黃芪能在組織細胞缺血缺氧時擴張血管、改善微循環，因而推測其也可能通過直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂質過氧化反應和自由基反應等多種機制拮抗自由基對組織的損害，從而使移植的耳蝸干細胞向早期毛細胞分化數量增多。另外移植后宿主局部組織的排斥反應會比較強烈，有研究表明當歸補血湯可增強T、B淋巴細胞增殖率，黃芪黃酮、黃芪皂苷以及黃芪和當歸的揮發油均有良好的雙向免疫調節作用[20]，所以我們也有理由推測當歸補血湯可能通過降低耳蝸內的移植排斥反應而提高移植的耳蝸干細胞存活，提高毛細胞的分化比例。其具體機制尚有待進一步研究。