【摘要】 藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證是新藥研發(fā)的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成成敗的關(guān)鍵因素之一。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展，以及RNA干擾、噬菌體展示等新興技術(shù)的出現(xiàn)，藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證技術(shù)日新月異。該文綜述了在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的各種技術(shù)的研究進(jìn)展及其成功案例。

【關(guān)鍵詞】 藥物靶標(biāo);靶標(biāo)發(fā)現(xiàn);靶標(biāo)驗(yàn)證

Abstract：Drug target discovery and verification is not only the first step of investigation of new drug， but also one of the most important factors in drug screening and directional synthesis. With the fast development of genomics， proteomics， bioinformatics and the advancement of new techniques， such as RNA interference and bacteriophage display， the discovery and verification of drug target is changing with every passing day. In the present paper， the development and successful cases of drug discovery and verification were reviewed.

Key words： Drug target;Target discovery;Target verification

藥物靶標(biāo)是尋找藥物的基礎(chǔ)，在過去的幾個(gè)世紀(jì)中，人們很大程度上是依賴目前已知的五百多個(gè)藥物靶標(biāo)來發(fā)現(xiàn)藥物。基因組研究表明，人類有3～4萬個(gè)基因和更多的蛋白質(zhì)，其中許多蛋白質(zhì)是控制人類疾病的潛在的藥物靶點(diǎn)，因此至少有 9/10 的藥物靶點(diǎn)蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證藥物新靶標(biāo)對(duì)闡明疾病原因、藥物作用機(jī)制具有重要意義，是產(chǎn)生“重磅炸彈”式創(chuàng)新藥物的源頭。近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展，以及RNA干擾、噬菌體展示等新興技術(shù)的出現(xiàn)，新的藥物靶標(biāo)搜尋和驗(yàn)證方法不斷出現(xiàn)。因此，本文擬從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，就藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。

1基因水平的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證

1.1從基因數(shù)據(jù)庫中搜尋藥物靶標(biāo)20世紀(jì)90年代以來，表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)數(shù)據(jù)庫被廣泛應(yīng)用于新基因搜尋，如成功搜尋到了組織蛋白酶K 和阿立新受體等[1]。相對(duì)于EST 數(shù)據(jù)庫，人類基因組數(shù)據(jù)庫的序列信息更為完整，但它不能提供不同組織的表達(dá)信息，因此人們開始將EST 數(shù)據(jù)庫與基因序列數(shù)據(jù)庫結(jié)合起來搜索新的藥物靶標(biāo)。2001年，3個(gè)不同研究小組分別應(yīng)用不同方法，以H3 受體為參照，利用BLAST，F(xiàn)AST-PAN 和TFAST 程序，搜索到5 種新的H4 基因，這些基因都以標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法確認(rèn)，可作為疾病治療候選藥物靶標(biāo)。

1.2基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是在微小的基片表面集成了大量的分子識(shí)別探針，應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。基因芯片技術(shù)可以同時(shí)篩選、鑒別藥物或疾病相關(guān)基因，同時(shí)將這些基因與之功能聯(lián)系起來，因此在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證過程中是一個(gè)強(qiáng)有力的工具。但是由于芯片技術(shù)本身尚不十分成熟，在大量數(shù)據(jù)處理之后還需要大量的驗(yàn)證工作;它反映的是mRNA 表達(dá)水平，而這未必與蛋白表達(dá)和功能一致，這使它在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制。雖然如此，仍有許多成功應(yīng)用的例子[2]。此外，基因芯片技術(shù)在阿爾茨海默病[3]、帕金森病[4]、惡性腫瘤[5]等疾病的藥物靶標(biāo)研究中也發(fā)揮了很大作用。

1.3基因敲除技術(shù)基因敲除(gene knockout)是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知、而功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它序列相近的基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。基因敲除模型在發(fā)現(xiàn)基因功能和藥物作用新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)方面具有高度價(jià)值，同時(shí)也有助于確定藥物作用于特定靶點(diǎn)后的不良反應(yīng)。目前，研究者正在系統(tǒng)地敲除鼠固有基因，并根據(jù)哺乳動(dòng)物生理學(xué)特點(diǎn)確定它們?cè)隗w內(nèi)的功能，這一研究足已覆蓋幾乎所有的蛋白質(zhì)和可用于藥物研究的基因家族，如離子通道、核激素受體、蛋白酶、磷酸二酯酶、激酶、磷酸酶及其它關(guān)鍵的酶類。同時(shí)，基因敲除技術(shù)也已廣泛應(yīng)用于確證藥物在免疫[6]、動(dòng)脈粥樣硬化[7，8]、高血壓病[9]、糖尿病[10]和腫瘤[11]等疾病中的作用靶點(diǎn)。

2轉(zhuǎn)錄水平的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證

2.1反義寡核苷酸技術(shù)反義寡核苷酸技術(shù)是利用反義寡核苷酸或修飾的寡核苷酸與特定靶mRNA 的一部分互補(bǔ)，抑制mRNA 的翻譯和剪接，從而抑制其編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。與基因敲除技術(shù)相比，盡管這種方法是一種更加省時(shí)省力的研究目的基因的強(qiáng)大工具，但還是有局限性，如體內(nèi)應(yīng)用時(shí)生物利用度有限，毒性較大。利用反義技術(shù)驗(yàn)證藥物靶標(biāo)也有一些成功的例子。如Jarvis等[12]利用磷酸化的反義序列作用于P2X3 受體的1100～1119 和1166～1185 位點(diǎn)序列，證明P2X3 受體是慢性炎癥和神經(jīng)痛的重要角色，據(jù)此為靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一種小分子A-317491。Okabe 等[13]利用cDNA 芯片技術(shù)分析臨床肝癌樣品發(fā)現(xiàn)，DDEFL1(development and differentiation enhancing factor-like 1)基因在肝癌組織中表達(dá)異常，進(jìn)而以硫代反義核酸抑制此基因的表達(dá)，結(jié)果腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制，提示DDEFL1 可以作為肝癌的潛在治療靶點(diǎn)。

2.2RNA干擾 (RNA interference， RNAi) 技術(shù)

2.2.1RNA干擾用于發(fā)現(xiàn)新藥靶RNA干擾技術(shù)自誕生以來，已被廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)與確證，這主要是由于該技術(shù)具有很多其他技術(shù)所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：能特異高效地抑制基因表達(dá)，獲得去基因功能表型;僅需要少量的核酸序列信號(hào)，而且不被蛋白結(jié)構(gòu)影響;siRNA 的合成和控制較基因敲除或其他方法簡(jiǎn)單易行、資金消耗少、周期短，使得我們能夠在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模篩選靶點(diǎn)，而且可以通過質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)的小發(fā)卡RNA(small hairpin RNA， shRNA)干擾目的基因，從而達(dá)到了在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平篩選藥物靶標(biāo)的目的[14， 15]。研究表明，RNAi 技術(shù)能快速有效地鑒別藥物新靶點(diǎn)，RNAi 文庫的應(yīng)用將為腫瘤和感染性疾病等的發(fā)病機(jī)制和治療研究提供理論依據(jù)和新的切入點(diǎn)。

2.2.2RNA干擾輔助藥物靶點(diǎn)的確證高通量篩選技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)和某種疾病相關(guān)的藥物靶點(diǎn)庫，然而要完全確定某蛋白在某種疾病中的重要性或某種蛋白在某種藥物發(fā)揮藥效中的作用，要看在動(dòng)物模型內(nèi)阻斷候選基因是否能減緩病癥或拮抗藥物原有的藥理活性，甚至在人體內(nèi)驗(yàn)證。鑒于近來向活體中轉(zhuǎn)染siRNA 技術(shù)的不斷提高，在動(dòng)物模型中的應(yīng)用也取得進(jìn)展，于是利用RNAi 阻斷模擬人疾病狀態(tài)的動(dòng)物模型中的基因的表達(dá)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行深入的鑒定和評(píng)價(jià)呈現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢(shì)。Brummelkamp 等[16]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的shRNA 表達(dá)系統(tǒng)靶向K-rasV12 的mRNA，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞，結(jié)果驗(yàn)證了K-rasV12 是胰腺癌中一個(gè)很好的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，同時(shí)也說明RNAi 可以驗(yàn)證藥物篩選中候選靶點(diǎn)在活體內(nèi)的功能，為鑒定候選靶點(diǎn)最終是否能作為新藥靶提供了有力的證據(jù)。

3蛋白水平的藥物靶標(biāo)

發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證人類基因組計(jì)劃大規(guī)模測(cè)序?yàn)閯?chuàng)新藥物的研究提供了前所未有的機(jī)遇，但是生命活動(dòng)是通過DNA 到RNA 到蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。藥物作用的基礎(chǔ)也是蛋白質(zhì)而非 RNA/ DNA [17]。蛋白水平的藥物靶標(biāo)研究具有更加重大的意義。迄今，已發(fā)現(xiàn)的大部分藥物靶標(biāo)都是來自蛋白水平研究。蛋白水平藥物靶標(biāo)的研究方法也是層出不窮，人們不僅通過蛋白質(zhì)組學(xué)[18， 19]、蛋白芯片[20]、噬菌體展示[21， 22]等技術(shù)大規(guī)模篩選藥物靶標(biāo)，而且還利用親和色譜[23～25]、酵母三雜交系統(tǒng)[26，27]、磁性納米探針技術(shù)[28]等發(fā)現(xiàn)了很多天然活性化合物或其衍生物的作用靶點(diǎn)。

3.1親和色譜技術(shù)在藥物靶標(biāo)研究的漫長發(fā)展歷程中，親和色譜技術(shù)是最經(jīng)典的一種技術(shù)。由于它具有能直接分離各種組織、細(xì)胞中的天然狀態(tài)蛋白、操作方便、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，長期以來被廣泛應(yīng)用于藥物靶蛋白的分離。迄今為止，親和色譜法已成功應(yīng)用于FK506[23]、環(huán)孢菌素[24]等多種藥物靶蛋白的搜尋。常用的親和色譜法包括固相洗脫、藥物競(jìng)爭(zhēng)法等，如果親和柱(柱材——藥物)與靶蛋白解離過慢，則很難洗脫下來，須制備無活性結(jié)構(gòu)類似藥物的對(duì)照柱;如果藥物溶解性差，蛋白會(huì)隨不溶的藥物沉淀，則無效。2006-05報(bào)道的一種稱為“系列親和色譜法”的改良親和色譜法，則不受藥物溶解性、配基-蛋白復(fù)合物解離速度的影響，適合于溶解性較差的化合物，該方法已經(jīng)甲氨喋呤、FK506 等藥物的靶點(diǎn)尋找上得到了驗(yàn)證[25]。作者也采用系列親和色譜法首次發(fā)現(xiàn)了麥冬活性成分——魯斯可皂苷元的特異性結(jié)合蛋白(另文發(fā)表)。

3.2噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是一種有效的藥物靶點(diǎn)篩選工具，它可以將外源蛋白或多肽呈現(xiàn)在噬菌體表面，利用外源蛋白或多肽與待篩選藥物的特異性親和作用，通過吸附-洗脫-擴(kuò)增的篩選富集過程，將表達(dá)與藥物特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽的噬菌體大量富集，然后通過測(cè)序分析即可得到與藥物特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽。這一技術(shù)將基因型和表型、分子結(jié)合活性和噬菌體的可擴(kuò)增性巧妙的結(jié)合起來，是一種高效的篩選體系，同時(shí)也是一種探討受體和配體之間相互作用的結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親合力結(jié)合配體的有力工具。據(jù)報(bào)道，Rodi[21]等利用噬菌體展示技術(shù)，對(duì)抗癌藥物紫杉醇進(jìn)行篩選，獲得了紫杉醇在體內(nèi)的藥物作用的靶點(diǎn)Bcl-2 蛋白。Jin[22]等利用噬菌體展示技術(shù)，通過固定化阿霉素篩選T7噬菌體人類肝臟的cDNA 文庫，得到了阿霉素的靶點(diǎn)蛋白hNopp140。

3.3三雜交系統(tǒng)三雜交系統(tǒng)(three-hybrid system)是近幾年在酵母雙雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的由活性小分子鑒定靶蛋白的方法。其基本原理與酵母雙雜交類似，只是在“鉤”與“魚”之間加了“餌”構(gòu)成三雜交中的3個(gè)組分：其中的“餌”是一種修飾過的活性小分子，是由活性小分子和配體A 連接而成：“鉤”是由配體A 的受體蛋白與DB 融合而成;“魚”是由cDNA 庫中的蛋白融合在AD 上構(gòu)成。當(dāng)待篩選靶組織的cDNA 庫中的某一蛋白與小分子相互作用時(shí)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng)，這時(shí)細(xì)胞可被明顯檢測(cè)。Becker 等用周期素依賴性蛋白激酶(CDK)抑制劑作為餌，采用該方法從人cDNA 庫中篩選到多種CDK抑制劑的靶蛋白[26]。此外，在哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中采用三雜交系統(tǒng)篩選活性小分子的靶蛋白也已獲得成功[27]。

3.4蛋白芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片是一種類似于基因芯片的高通量篩選方法。利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可以從正常細(xì)胞和病變細(xì)胞的蛋白質(zhì)的變化中發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)蛋白，這些相關(guān)蛋白經(jīng)研究篩選后可能成為藥物的新靶點(diǎn)。Fong 等[20]借助蛋白質(zhì)芯片發(fā)現(xiàn)TROP2 將成為口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌的診斷治療和抗口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌藥物研究的新靶點(diǎn)。

4展望

雖然目前確定的藥物靶點(diǎn)還很少，藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證的各種方法也存在種種不足，毫無疑問人類基因組框架圖的繪制完成，功能基因組研究的深入，為發(fā)現(xiàn)更多藥物靶標(biāo)提供了可能，這將有利于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的進(jìn)程。同時(shí)，生命科學(xué)與化學(xué)、物理學(xué)、信息學(xué)等其他學(xué)科進(jìn)一步的交融，將為各種技術(shù)方法不斷發(fā)展完善奠定基礎(chǔ)。相信隨著功能基因組研究的深入及生物技術(shù)的快速發(fā)展，人類將能夠更加明確地闡明疾病的病理生理機(jī)制、藥物治療作用及其毒性作用的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多可以治療疾病的藥物作用靶點(diǎn)或靶點(diǎn)組合，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)更好的藥物，提高人類的生活質(zhì)量。