【摘要】 目的 進一步探討中藥腎樂方的腎臟保護作用機制。方法 將48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為6組：正常組、模型對照組、強的松組、中藥低、中、高劑量組(中藥腎樂方治療)。采用表柔比星尾靜脈注射法復制微小病變腎病(MCNS)大鼠模型，分別給予不同劑量腎樂方藥液、強的松混懸液。測定大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、三酰甘油、尿素氮、肌酐、血清及腎組織內皮素(ET)的水平，并進行電鏡下腎臟組織形態(tài)學觀察。結果 與正常組比較，模型對照組血清、腎組織ET質量濃度均有不同程度增高(P<0.05～0.01)。腎樂方可減少MCNS大鼠尿蛋白的排泄量，改善血清生化指標，降低血清及腎組織ET質量濃度(P<0.05～0.01)，修復腎小球上皮細胞足突的結構。結論 MCNS大鼠ET質量濃度升高，腎樂方對MCNS大鼠有明顯療效，并能抑制其增高的ET表達，從而減輕腎臟病理損害，緩解腎病。

【關鍵詞】 腎變病綜合征/藥物療法; 內皮素; 腎樂方/治療應用; 中草藥; 動物，實驗

【Abstract】 Objective To investigate the effects of Shenlefang in MCNS rats.Methods A total of 48 MCNS model rats were induced by ADR venoclysis through caudal vein.The rats were randomly pided into six groups:the normal control group，the model control group，the positive control group，the lowdosage of Chinese herbs group，the middledosage of Chinese herbs group，the highdosage of Chinese herbs group.Different treatment were given to the six groups.We observed the amount of protein in urine，determined the levels of Alb，TC，TG，BUN，Scr and ET in serum and ET in kidney，and observed morphologic change in kidneys.Results Compared with the normal group，the levels of ET in serum and kidney tissue of rats in the model groups were increased(P<0.05～0.01).Shenlefang could decrease the amount of protein in urine and the TC，TG，BUN，Scr and ET in serum or kidney(P<0.05～0.01)，and repair injured foot process of glomerule epithelial cell.Conclusion ET may be concerned with the pathogenesis of MCNS.Shenlefang has obvious protective effect on MCNS rats，inhibit the ET expression in serum and kidney，and prevent the further development of MCNS，hence reduce the pathologic damage to kidney and alleviate kidney disease.

【Key words】 Nephrotic syndrome/medicinal therapy; Endothelin(ET); Shenlefang/treatment application; Chinese herbs; Animal，experiment

微小病變腎病(Minimal change nephrotic syndrome，MCNS)是小兒原發(fā)性腎病綜合征的常見病理類型，屬中醫(yī)學“水腫”范疇。腎樂方系浙江省著名中醫(yī)兒科專家馬蓮湘教授治療小兒原發(fā)性腎病綜合征的經驗方，經多年臨床使用，療效顯著。前期研究表明，腎樂方對腎病綜合征大鼠有明顯療效，可抑制重要介質白細胞介素(IL)8和腫瘤壞死因子(TNF)α的分泌，改善其免疫功能[1]。為進一步探討腎樂方的作用機制，本研究應用典型的MCNS動物模型，進行中藥治療，觀察腎樂方對大鼠血清及腎組織內皮素(ET)表達的影響，初步探討其腎臟保護作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物 同批清潔級健康雄性SD大鼠48只由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物實驗合格證：SYXK(浙)20030003，體質量(180±10)g。中藥腎樂方(生黃芪、生地、白茅根、白花蛇舌草、水蛭、丹參等)煎煮后，過濾濃縮為低、中、高3種劑量溶液(生藥質量濃度分別為1，2，4 g/mL)。強的松片(浙江仙居制藥有限公司，批號：051111)，每片5 mg，用蒸餾水配制成2 g/L的混懸液。注射用鹽酸表柔比星(浙江海正藥業(yè)有限公司，批號：060105)，每瓶10 mg，用生理鹽水配制成2 g/mL的溶液。

1.2 試劑和儀器 ET試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：060516)。BECKMAN型離心式全自動生化儀(美國實驗儀器公司)，722分光光度儀(美國PACKARO公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 所有大鼠實驗前24 h尿蛋白定量均正常。適應性喂養(yǎng)1周后，按簡單隨機化原則分為6組：正常組、模型對照組、強的松組和中藥低、中、高劑量組，每組8只。除正常組大鼠經尾靜脈1次性注射等量生理鹽水外，其余各組參照文獻[2]造模：經大鼠尾靜脈一次性注射2 g/mL表柔比星溶液(劑量6 mg/kg)。

1.3.2 分組給藥 自造模當日起，觀察組大鼠分別給予不同劑量腎樂方中藥液、強的松混懸液，正常組、模型對照組給予等量生理鹽水作為安慰對照，灌胃量10 mL/(kg·d)。每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.3.3 指標測定 實驗第7，14，21，28天分別置大鼠于代謝籠中，留取24 h尿量，用比色法測定大鼠24 h尿蛋白定量。給藥結束后第2天，各組大鼠麻醉后摘眼球取3 mL血兩管，分離血清，一試管采用全自動生化儀測定血清白蛋白(Alb)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平;以放射免疫法測定另一試管血清及腎臟組織上清液ET的質量濃度，嚴格按試劑盒說明操作。處死大鼠，無菌操作摘取左腎，去包膜，取100 mg腎組織加0.9 mL生理鹽水，勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清液。腎皮質部位取材，以2.5%戊二醛溶液固定，超薄切片，染色后行電鏡下腎臟組織超微結構觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量數據以±s表示，組間差異的比較采用單因素方差分析，顯著性水準為P<0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較 實驗第7，14，21，28天，模型對照組尿蛋白定量較正常組明顯升高(P<0.01);各觀察組尿蛋白定量均較同期模型對照組降低(P<0.05～0.01)，見表1。表1 正常大鼠及微小病變腎病各組大鼠24 h尿蛋白定量的比較注：與正常組比較，aP<0.01;與模型對照組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 各組大鼠血液生化指標比較 模型對照組較正常組血清Alb水平明顯降低，TC，TG，BUN，SCr水平明顯增高。各觀察組較模型對照組血清Alb水平增高，TC，TG，BUN，SCr水平降低，見表2。表2 正常大鼠及微小病變腎病各組大鼠血液生化指標的比較注：與正常組比較，aP<0.01;與模型對照組比較，bP<0.01，cP<0.05。

2.3 各組大鼠血清、腎組織ET比較 模型對照組血清、腎組織ET質量濃度較正常組明顯增高(P<0.05～0.01)。各觀察組較模型對照組血清、腎組織ET降低(P<0.05～0.01)，見表3。表3 正常大鼠及微小病變腎病各組大鼠血清、腎組織ET質量濃度比較注：與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01;與模型對照組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 腎臟組織超微結構觀察 透射電鏡觀察正常組大鼠腎小球基底膜上皮細胞和內皮細胞無異常，足突無水腫融合現(xiàn)象;模型對照組大鼠腎小球上皮細胞足突極大部分融合，符合微小病變腎病的病理改變;中藥低劑量組大鼠腎小球上皮細胞足突有節(jié)段性融合;其余觀察組大鼠腎小球病變程度相似，基底膜平滑，未見增厚，系膜未見增生，足突極小部分融合，與模型對照組比較病變程度明顯減輕。

3 討論

原發(fā)性腎病綜合征是兒科常見病，占兒科腎臟疾病的18.6%，僅次于急性腎炎，且有逐年上升的趨勢[3]。MCNS是小兒原發(fā)性腎病綜合征的常見病理類型，約占75%，其發(fā)病因素尚未完全明確。ET是一種使血管強烈收縮的生物活性肽，是目前已知體內作用最強、作用時間最持久的縮血管物質;除此之外還是一種炎癥介質和致纖維化介質，對腎臟功能損害具有明顯的作用。ET在腎組織內通過自分泌和旁分泌作用發(fā)揮多種病理生理學效應[4]。研究表明，ET可直接作用于血管平滑肌細胞引起腎血管收縮;還可引起腎系膜細胞分裂、增生和收縮，導致腎小球毛細血管叢缺血，使腎小球濾過率、腎血漿流量下降，并使細胞外基質蛋白合成增加，腎小球基底膜陰電荷丟失，毛細血管通透性增加，造成蛋白尿的產生[5]。已有研究表明表柔比星腎病大鼠的蛋白尿水平和腎組織ET水平呈顯著正相關。腎皮質ET水平的改變會引起腎皮質血流量的改變，在腎損傷達一定程度時，腎血流量的下降會導致尿蛋白的增加。腎皮質ET的異常增多是導致表柔比星誘發(fā)大鼠腎病蛋白尿發(fā)生發(fā)展的途徑之一[6]。筆者應用經典的表柔比星腎病模型，于注射表柔比星的第1周大鼠開始出現(xiàn)蛋白尿，并逐步增多，至第4周達到高峰，并呈現(xiàn)大量低蛋白血癥、高脂血癥，表明MCNS模型制備成功，并存在血清、腎組織ET水平的異常增高(P<0.05～0.01)。

腎病病程長，病因涉及內傷、外感，病理維系臟腑、氣血、陰陽，其關鍵病理因素是水濕為著。水濕貫穿腎病始終，成為損傷正氣、阻礙氣機的主要因素，同時進一步化熱，使瘀血形成。腎病日久，蛋白尿流失過多，陽損及陰，使真陰虧損，虛熱內生，更因長期使用激素助火生熱，濕熱互結，病情反復，遷延難愈。其病機屬性為本虛標實、虛實夾雜之病證。氣陰兩虛、濕熱瘀阻不僅是腎病的病機關鍵，也是其病變過程中的常見證型。本著“治病求本”和“扶正祛邪”的原則，腎樂方中黃芪益氣固表，使患兒“表實”而無外邪侵襲之憂，肺脾氣充而無精微下泄之虞;生地、白茅根養(yǎng)陰生津以補精之不足;白茅根又“主勞傷虛羸，補中益氣，除瘀血、血閉塞熱，利小便”，與蛇舌草共奏清熱解毒利濕之功;丹參活血化瘀，配合“血肉有情之品”;水蛭則祛瘀力更強，使瘀去濕化，以防“血不利則為水。”黃芪、生地、白茅根益氣養(yǎng)陰生津以扶正，白花蛇舌草、丹參、水蛭清熱解毒、利濕化瘀以祛邪，則邪去正安。實驗結果發(fā)現(xiàn)，腎樂方可以降低模型大鼠血清、腎組織ET含量(P<0.05～0.01)，并呈一定的劑量-效應關系，提示腎樂方可能是通過降低ET含量，減輕機體組織細胞的損傷，同時尿蛋白排泄量也隨之減少，從而減輕腎臟病理損害，緩解腎病。

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