作者：劉霞 包翠芬 張曉明 穆長征

【摘要】 目的： 對生后小鼠腎臟發生發育不同階段中神經型一氧化氮合酶（nNOS)的表達進行定量分析，探討nNOS在小鼠生后腎臟發育中的意義。方法： 分別取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6組，用免疫印跡技術和光密度分析方法對各組小鼠生后腎神經型一氧化氮合酶進行定量檢測，以測得的一氧化氮合酶最大量為 1( 100% ) ，計算蛋白相對含量， SPSS10. 0統計軟件包統計分析。結果： 新生組酶含量最高為100%， 隨年齡增長酶含量逐漸減少，至成年達到最低水平為44.8±2.4% 。 結論： 這一趨勢表明nNOS可能在小鼠生后腎臟發育的早期階段起重要調節作用。

【關鍵詞】 小鼠 ; 腎 ; 神經型一氧化氮合酶

一氧化氮（NO）作為體內重要的信使分子和效應分子，在調節腎臟血流動力學方面具有重要的作用。腎臟中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化產生。NOS有三個亞型，即神經型一氧化氮合酶(nNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)［1］。目前對腎發生發育過程中NO和 NOS的研究還剛剛起步 ，本實驗通過定量方法檢測生后小鼠的發生發育不同階段nNOS的含量，旨在探討nNOS在小鼠腎臟發生發育中的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 成年健康昆明小鼠（遼寧醫學院實驗動物中心提供）。根據小鼠孕程確認仔鼠出生時間 ，取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6組。

1.2 主要試劑 nNOS兔抗鼠多克隆抗體（北京中杉公司）；細胞裂解液、丙稀酰胺、N，N亞甲基雙丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、TritonX100、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。

1.3 Western blot步驟 各組小鼠麻醉后剖腹取右腎，PBS沖洗，迅速置于液氮冷凍，-70℃冰箱保存。取冷凍腎組織，加入3倍體積的細胞裂解液，0℃下剪碎、勻漿，將組織勻漿液靜置30min，4℃，12000rpm 離心10min，留取上清液。用Bradford法測定蛋白含量，分裝成每離心管中含10μg蛋白，-20℃冰箱保存。 配制10%分離膠和5%濃縮膠，取10μg(30μl)腎組織蛋白細胞裂解上清液，加入10μl SDS樣品緩沖液，100℃加熱3min，離心。取上述裂解液加入電泳膠樣品槽，100V電壓下電泳，待樣品到達合適位置，停止電泳，將膠板取下，轉膜液洗滌10～30min。將膠與0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇內浸透5min左右，再放入轉膜液中至少5min)置于厚濾紙(已用轉膜液浸泡)之間，趕盡氣泡，常溫下半干轉印，轉印完成后將PVDF膜用TBST(TBS1%Tueen20溶液)沖洗，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1～2h。與一抗(兔抗小鼠nNOS抗體，稀釋度為1∶400)4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次至少5min； 再與二抗(堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG抗體，稀釋度為1∶200)室溫孵育1h，TBST溶液洗脫3次， 每次至少5min；NBT/BCIP顯色；掃描電泳條帶，輸入電腦，用光密度分析軟件分析電泳條帶光密度。

1.4 統計學分析 SPSS10.0統計軟件包統計分析，組間比較采用 q檢驗，以 P<0.05為有統計學意義，P<0.01為有明顯統計學意義。

2 結果 生后小鼠腎臟發生發育不同階段 nNOS含量分析 Western blot電泳條帶圖顯示新生小鼠nNOS含量最高，隨著腎臟發生發育逐漸降低，到成年降低至最低水平。光密度分析顯示：以測得的nNOS最大量為1，計算各組nNOS表達相對含量（百分數）。新生小鼠nNOS含量最高（100%），出生后3天降低，生后5天進一步降低，到成年降至最低水平。見表 1。

表1 小鼠生后不同階段腎臟nNOS表達的光密度百分數（略）

注：*與成年組比較，P<0.01；#與新生組比較，P<0.05。

3 討論 本實驗表明生后小鼠發生發育不同階段中，新生小鼠腎臟的nNOS含量最高（P<0.05）。nNOS是一種結構酶，其表達越多，則可能產生NO越多，作為新生小鼠體內唯一的血管舒張因子，通過對抗高活性血管收縮因子特別是血管緊張素Ⅱ的作用，可增加腎血流量（RBF）及腎小球濾過率（GFR），調節腎臟正常的生理活動［2］。生后小鼠早期階段高腎血管阻力（RVR）、低RBF、低GFR的生理特點是促使nNOS表達的主要因素，可見nNOS在腎臟功能發育的早期對腎血液動力學的調節起著重要作用。此外nNOS的表達還與細胞自身的生長發育與增殖、母體較高的雌激素水平相關，另外生長因子、低氧也能上調nNOS的表達［3，4］。 在生后小鼠腎臟發生發育中，隨著腎單位的形成、集合管的分化，腎功能也進一步完善，體現在RBF與GFR增加、腎小管重吸收功能完善等諸多方面。有研究表明： NOS抑制劑可以減少25%左右的腎血流量［5］。可見源于nNOS的NO對血流動力學的調節起著關鍵性作用，仍是維持腎血管低張力的必要物質和重要調節劑。但是隨著腎臟本身結構與功能日趨完善，NO的調節作用較生后小鼠腎臟發育早期有所降低，表現為nNOS表達含量的降低。在生后小鼠腎臟發育后期，NO主要通過球旁反饋機制調節腎臟功能。生理學認為動物在成熟過程中許多器官和組織都能產生腎素，有局部的腎素血管緊張素系統存在，而在成年小鼠腎臟中，血管緊張素Ⅱ可以通過腎素受體下調nNOS的含量而改變腎動脈血管張力［6］。這可以解釋免疫印跡中生后小鼠腎臟中nNOS表達含量呈降低趨勢的實驗結果。另外，在生后腎發育過程中腎間質增多，腎實質比例減少，也使單位體積nNOS含量降低?？傊谏笮∈竽I臟發育不同階段，nNOS表達呈動態變化，這種變化不僅與其結構與功能發育相適應，而且還受自身所處環境影響。新生小鼠的腎臟nNOS表達含量最高，成年小鼠nNOS表達含量最低，這一趨勢表明nNOS可能在生后小鼠腎臟發育的早期階段起重要作用。