【摘要】 目的 觀察Calbindin-D28k在小鼠腎發(fā)生發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律。方法 應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)對各組小鼠腎Calbindin-D28k的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。結(jié)果 胚齡12 d Calbindin-D28k表達(dá)量極低；胚齡14 d到胚齡16 d表達(dá)量增加；胚齡16 d到胚齡18 d表達(dá)量無顯著性變化；胚齡18 d到生后7 d表達(dá)量明顯增加；生后7 d到生后14 d，Calbindin-D28k表達(dá)量減少。生后14 d到生后40 d，Calbindin-D28k表達(dá)量無顯著性差異。結(jié)論 從胚齡12 d到生后7 d期間Calbindin-D28k表達(dá)的逐漸增強(qiáng)與小鼠腎鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力的完善可能有一定的關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 Calbindin-D28k 小鼠 腎發(fā)育

Abstract：Objective To observe the expression rules of Calbindin-D28k during renal development of mouse. Methods Western blotting technique was used to measure the protein content of Calbindin-D28k at different development stages of embryonic and postnatal mice. Results At E12， Calbindin-D28k expression could be hardly detected in the kidney. From E14 to E16， the expression was increased. There was no significant difference from E16 to E18. From E18 to N7， the expression of Calbindin-D28k was increased obviously. From N7 to N14， the expression of Calbindin-D28k was decreased. There was no significant difference between N14 and 40. Conclusions The expression of Calbindin-D28k is weak at E12， and is enhanced with ages to the peak at N7， and decreased thereafter. Calbindin-D28k is a calcium ferry protein in cytoplasm and is very important to renal calcium reabsorption during the development of kidney.

Key words：Calbindin-D28k; mouse; renal development

Calbindin-D28k最初是由Wasserman和Taylor［1］于1966年在雞小腸粘膜中發(fā)現(xiàn)的，其分子量約為27.8×103，由于在小腸中的合成受1，25-二羥基維生素D3水平的調(diào)節(jié)，故又被稱為維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白（Vitamin D-dependent calcium binding protein，CaBP）［2］。Calbindin-D28k與腎發(fā)育關(guān)系的研究國外曾見報道［3，4］，但關(guān)于小鼠腎發(fā)育中Calbindin-D28k表達(dá)的定量研究國內(nèi)尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白印跡（Western blotting）技術(shù)定量檢測小鼠腎發(fā)育過程中Calbindin-D28k的表達(dá)規(guī)律，探討其與小鼠腎發(fā)育之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

25～30 g 成年健康昆明小白鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供［醫(yī)動字第 SCXY(遼)2003-2007號］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Calbindin-D28k單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供;PVDF膜、SDS、NBT/BCIP、Tween-20、NP-40、PMSF等由SIGMA公司提供。

1.3 標(biāo)本制備

選用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例1∶1同窩飼養(yǎng)，以陰道栓脫落的最早時間計為胚齡（E）0 d［5］。孕鼠分籠飼養(yǎng)，每日早8∶00、晚5∶00觀察生產(chǎn)情況，以仔鼠出生的最早時間計為生后（N）0 d。分別取E10、12、14、16、18 d胎鼠和N1、3、7、14、21、40 d仔鼠，每組8只，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。

1.4 Western blotting定量檢測Calbindin-D28k

各組小鼠取右腎，入液氮迅速冷凍，-85 ℃冰箱保存待用。取冷凍待用的右腎組織，置于1～2 mL勻漿器中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加入4倍體積的裂解液(50 mM Tris-HCl，，pH 8.0 150 mM NaCl，100 μg/mL PMSF，1% TritonX-100) 0 ℃下勻漿、冰上裂解30 min，冷凍離心機(jī)(12 000 r/min) 4 ℃，20 min離心去除細(xì)胞碎片，取上清液，用考馬斯亮蘭法測定總蛋白含量。每個樣品取25 μg與5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液混合，煮沸5 min，100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗-Calbindin-D28k單克隆抗體(稀釋度為1∶400)，二抗-生物素化山羊抗小鼠IgG（稀釋度為1∶700 )， NBT/BCIP試劑顯色，掃描電泳條帶 ，用Gene Tools軟件分析電泳條帶凈吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各胚（日）齡小鼠腎Calbindin-D28k表達(dá)量電泳結(jié)果見圖1，凈吸光度值見表1、圖2。胚齡12 d，Calbindin-D28k表達(dá)量極低，無法檢測。胚齡14 d到胚齡16 d，Calbindin-D28k表達(dá)量增加，差異有顯著性意義［（12.0994±0.6911），（13.2383±0.1729），P<0.01］。 胚齡16 d到胚齡18 d，Calbindin-D28k表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05)。胚齡18 d到生后7 d，Calbindin-D28k表達(dá)量明顯增加，差異有顯著性意義［（13.8447±0.2385），（15.2718±0.2019），（16.3208±0.2839），（19.3383±0.4044），P<0.01］。生后7 d到生后14 d，Calbindin-D28k表達(dá)量減少，差異有顯著性意義［（19.3383±0.4044），（15.8915±1.0185），P<0.01］。生后14 d到生后40 d，Calbindin-D28k表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)。表1 各胚（日）齡小鼠腎Calbindin-D28k表達(dá)量（略）注：aP＜0.01，與前一胚（日）齡比較有顯示性差異

3 討 論

Calbindin-D28k是一種細(xì)胞內(nèi)與鈣高親和力蛋白，存在于與鈣轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的組織中。從系統(tǒng)發(fā)育的角度看，Calbindin-D28k是一個古老的大分子，在進(jìn)化早期，它僅是一個神經(jīng)蛋白，隨著向更高的種族發(fā)育，它才被存留于其他組織中，如腎臟、腸道和胎盤［6］。在腎臟，Calbindin-D28k定位于遠(yuǎn)端腎單位的遠(yuǎn)曲小管、連接小管、皮質(zhì)集合管［7］。

在前期研究中，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合圖象分析方法發(fā)現(xiàn)Calbindin-D28k在胚齡12 d小鼠胎鼠輸尿管芽上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見微弱的表達(dá)。胚齡16 d Calbindin-D28k在輸尿管芽壺腹可被明顯的觀察到，并且隨著腎單位發(fā)育即S小體的出現(xiàn)，在S小體與輸尿管芽壺腹之間的連接小管也出現(xiàn)微弱表達(dá)。隨著腎發(fā)育，Calbindin-D28k的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，最終定位于小鼠腎遠(yuǎn)曲小管、連接小管和皮質(zhì)集合管。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用蛋白印跡技術(shù)對Calbindin-D28k表達(dá)進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn) Calbindin-D28k從胚齡12 d的胎鼠開始表達(dá)到生后7 d的小鼠其表達(dá)量逐漸增加，而從生后7 d到生后40 d的小鼠，陽性表達(dá)稍減少并趨于平穩(wěn)，沒有顯著性的變化。推測從胚齡12 d到生后7 d期間Calbindin-D28k表達(dá)的逐漸增強(qiáng)與小鼠腎鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力的完善有一定的關(guān)系。關(guān)于Calbindin-D28k的生理功能，學(xué)者們提出了幾種理論：載體學(xué)說認(rèn)為Calbindin-D28k作為一種運(yùn)輸?shù)鞍祝膳c鈣離子結(jié)合并參與細(xì)胞內(nèi)鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。緩沖理論認(rèn)為Calbindin-D28k可能是細(xì)胞內(nèi)鈣緩沖劑，通過與鈣離子結(jié)合來保持細(xì)胞內(nèi)鈣的平衡，防止達(dá)到中毒劑量，以保持組織細(xì)胞的正常發(fā)育。活化劑理論認(rèn)為Calbindin-D28k增加了管壁膜鈣通道的活性，或Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力 ，因而增加了鈣的重吸收［8］。總之，對Calbindin-D28k在腎表達(dá)的相關(guān)研究，將有助于增進(jìn)對腎發(fā)生發(fā)育的認(rèn)識，有利于闡明Calbindin-D28k在腎鈣轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，從而為臨床腎鈣平衡失調(diào)的研究提供基本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。