作者：賀曉蕊 于京華 葛慎光 張秀明 林青朱晗 封爍 袁靚 黃加棟

【摘要】 構建了基于多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）和鉑納米顆粒（Pt-nano）的電流型L-乳酸生物傳感器。將Sol-gel膜覆蓋在L-乳酸氧化酶（L-lactate oxidase，LOD）和MWCNTs/Pt-nano修飾的電極表面。實驗結果表明：傳感器的最佳工作條件為：檢測電壓0.5 V；緩沖液pH 6.4；檢測溫度25 ℃。此傳感器的響應時間為5 s， 靈敏度是6.36 μA/（mmol/L）。連續檢測４星期其活性仍保持90%，線性范圍為0.2~2.0 mmol/L，且抗干擾能力強。在實際血樣的檢測中，此傳感器與傳統的分光光度法具有很好的一致性。

【關鍵詞】 生物傳感器； L-乳酸； 溶膠-凝膠； 鉑納米顆粒； 多壁碳納米管

Abstract An electrochemical L-lactate biosensor was fabricated by combining Platinum nanoparticles(Pt-nano) with multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs).L-lactate oxidase(LOD) was immobilized on the surface of the glassy carbon electrode(GCE) modified with MWCNTs and Pt-nano.The surface of resulting LOD/MWCNTs/Pt-nano electrode was covered by a thin layer of sol-gel to avoid the loss of LOD and to improve the anti-interference ability.The cyclic voltammetric results indicated that MWCNTs/Pt-nano catalyst displayed a higher performance than MWCNTs.Under the optimized conditions，i.e.，applied potential of 0.5 V，pH 6.4，25 ℃，the proposed biosensor’s determination range was 0.2－2.0 mmol/L，response time was within 5 s，and the sensitivity was 6.36 μA／（mmol/L）.It still kept 90% activity after 4 weeks.The fabricated biosensor had practically good selectivity against interferences.The results for whole blood samples analyzed by the present biosensor showed a good agreement with those analyzed by spectrophotometric method.

Keywords Biosensor； L-lactate； Ｓol-gel； Ｐlatinum nanoparticles； Ｍulti-walled carbon nanotubes

1 引言

臨床醫學、牛奶工業、葡萄酒工業、生物技術和運動醫學等領域都需要靈敏、快速的L-乳酸檢測方法。特別是血乳酸水平能夠反映人體的多種病理狀態。傳統的L-乳酸的檢測主要采用分光光度計法〖1〗。但這種方法過程復雜、成本高。生物傳感器因其選擇性高、響應快和重復性好等優點被認為是最適合的生化分析儀器之一。目前，關于檢測乳酸含量的電化學傳感器已有報道〖2，3〗。但簡便、便宜和選擇性高的L-乳酸傳感器依然是目前研究的熱點。

碳納米管（Carbon nanotubes，CNTs）擁有許多特殊性質，如高電導性、高化學穩定性，以及非常高的機械強度和系數〖4，5〗。CNTs包括單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）。當被用作電化學反應的電極材料時，SWCNTs和MWCNTs都有提高電子轉移反應的能力。研究表明：MWCNTs可增強電極表面的電催化活性和增大其表面積〖6〗。文獻〖7～９〗表明：CNTs修飾的電極能夠顯著增強兒茶酚胺神經傳遞素、細胞色素C、抗壞血酸、NADH和肼復合物的電化學性能。CNTs能夠提高NADH和H2O2的電子轉移反應，這表明它在基于脫氫酶和氧化酶的電流型生物傳感器方面有廣闊的應用前景〖１０〗。鉑納米顆粒（Patinum nanoparticles，Pt-nano）是一種有效的酶傳感器的構建材料。它具有很好的生物相容性、大的表面積及對H2O2的催化能力強〖11〗。

本研究構建了基于MWCNTs和Pt-nano的電流型L-乳酸生物傳感器。為阻止電極表面上的酶分子的丟失和提高傳感器的抗干擾能力，采用Sol-gel膜〖12，13〗覆蓋LOD/MWCNTs/Pt-nano電極表面。對構建的生物傳感器的檢測范圍、響應時間、敏感性和穩定性進行了研究。考察了pH值、電位、溫度和電活性干擾物對傳感器電流的影響， 并將此傳感器應用于全血分析。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

L-乳酸氧化酶（LOD，E.C.1.1.3.2，34 units/mg，from Pediococcus species）、二甲基亞砜（DMＳＯ）、正硅酸四乙酯（TEOS，99%）、Triton X 100均購自Sigma公司；L-乳酸、L-乳酸鋰購自Fluka公司；多壁碳納米管（MWCNTs，直徑約15 nm，純度95%，中科院成都有機化學研究所）；氧化鋁粉末（Merck公司）；H2PtCl6·6H2O（天津市第二化學試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4，0.1 mol/L KCl）作為支持電解質。其它試劑均為分析純，無需純化直接使用。實驗用水為去離子水。電化學測試在283電化學工作站（EG & G，USA）上進行，使用270軟件。采用傳統的三電極體系：Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾的玻璃碳電極（Glass carbon electrode，GCE，Φ=3 mm）作為工作電極，鉑片作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極。電流的測定是在攪拌的條件下進行的。

2.2 Sol-gel標準溶液、納米鉑溶液和MWCNTs標準溶液的配制

在燒杯中按照一定的比例加入TEOS，H2O和0.1 mol/L HCl，不停地攪拌該混合溶液直到溶液變清澈，即得Sol-gel儲備溶液。此儲備溶液被應用于整個實驗中，并可根據需要對其進行稀釋。

根據文獻〖14〗制備Pt-nano溶液。將4 mL 5% H2PtCl6·6H2O溶液加入到340 mL蒸餾水中，在80 ℃下邊攪拌邊加熱。加入60 mL 1%檸檬酸鈉溶液后，在（80±0.5） ℃保溫4 h。此過程通過吸附光譜記錄。當PtCl２－6的吸附帶消失的時候， 表明反應結束。

圖1 Pt-nano的TEM圖（放大倍數100000）（略）

Fig.1 Transmission electron micrograph of platinum nanoparticles(Pt-nano)(×100000)

將2 mg MWCNTs加入到1 mL二甲基亞砜溶液中，超聲攪拌，制備成黑色懸濁液狀的MWCNTs溶液。

2.3 制備Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾的酶電極

用0.05 μm Al2O3粉打磨玻碳電極，超聲清洗，再分別用1 mol/L HNO3和1 mol/L NaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗。20 μL MWCNTs和20 μL鉑納米顆粒混合制成貯備溶液，超聲40 min，得到均勻分散的MWCNTs和Pt-nano溶液。

將10 μL MWCNTs和Pt-nano溶液滴加到玻璃碳電極的表面，使之均勻分布在電極的整個表面上，然后將電極在室溫下干燥30 min。再用2 μL LOD溶液覆蓋MWCNTs和Pt-nano復合膜修飾的電極表面。在室溫下干燥20 min后，加6 μL Sol-gel儲備溶液到酶層的表面，然后在室溫下干燥。最后，將酶電極浸入到pH 6.8的緩沖液中，保存在4 ℃的冰箱中過夜，以便除去電極表面過量的L-乳酸氧化酶。用去離子水徹底清洗電極，即得Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾的電極。

3 結果與討論

3.1 Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修飾電極的電化學特性

研究了MWCNTs/Pt-nano和MWCNTs修飾的電極對L-乳酸的電催化行為。由圖2可見，MWCNTs/Pt-nano和MWCNTs都能增加傳感器的電流響應。 圖2 裸電極(a)、MWCNTs修飾的電極（b）、MWCNTs/Pt-nano修飾的電極(c)的CV圖（略）

Fig.2 Cyclic voltammograms of L-lactate on bare GCE(a)，MWCNTs modified electrode(b)，MWCNTs/Pt-nano modified electrode(c)

1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)，掃描速率(Scanning rate) 50 mV/s，0.1 mol/L PBS，電壓（Polential） 5 V，pH 6.4.但是MWCNTs/Pt-nano修飾的電極顯示出比MWCNTs修飾的電極有更好的電流增效作用。由圖2中曲線b和c可見，MWCNTs/Pt-nano修飾的電極對L-乳酸的電催化活性比MWCNTs修飾的電極強。因為MWCNTs/Pt-nano修飾電極的電化學性能得到了提高，電子能夠更容易快速地在酶和MWCNTs/Pt-nano層之間傳遞。

3.2 pH值對傳感器響應的影響

研究了pH值在5.6~8.0范圍內變化對傳感器電流響應的影響（圖3）。不同pH值的L-乳酸標準溶液的濃度均為1 mmol/L。實驗表明： pH<6.4時，傳感器的響應電流隨著pH值的增大而顯著增大； pH=6.4時，傳感器的響應電流達到最大；pH>6.4時，傳感器的響應電流下降。本實驗選擇pH 6.4的緩沖液作為檢測L-乳酸的緩沖液。

3.3 溫度對傳感器響應的影響

在pH 6.4的緩沖液中，研究了5~50 ℃范圍內溫度對傳感器響應電流的影響（圖4）。在5~25 ℃范圍內，隨著溫度的提高，傳感器的響應電流逐漸增大; 在25 ℃條件下，反應達到最大值; 然后隨著溫度的提高，傳感器的響應電流快速下降，這可能是因為高溫使酶變性造成的。在較高的溫度下，蛋白質的三維結構被破壞，酶分子的構象被打開，從而失去了活性〖15〗。

圖3 緩沖液pH值對傳感器響應的影響（略）

Fig.3 Effect of pH of buffer solution on response of biosensor

1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； 0.5 V. 圖4 溫度對傳感器響應的影響（略）

Fig.4 Effect of temperature on response of biosensor

1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； pH 6.4； 0.5 V.

3.４ 電流反應和工作曲線

在上述優化條件下，探討生物傳感器對L-乳酸的響應。實驗在攪拌的0.1 mol/L pH 6.4的緩沖液中進行。圖5a和圖5b分別為在未加入Pt-nano（A）和加入Pt-nano（B）的情況下酶電極的電流響應的標定曲線。實驗結果表明：修飾有MWCNTs/Pt-nano的電極的電流響應高于只修飾有MWCNTs的電極。修飾有MWCNTs的電極達到95%信號的響應時間小于15 s。傳感器反應的線性范圍是0.25~2.0 mmol/L; 靈敏度是3.99 μA/(mmol/L); 相關系數為0.989; 檢出限為0.01 mmol/L（S/N=3）。修飾有MWCNTs/Pt-nano的電極達到95%信號的響應時間小于5 s。傳感器反應的線性范圍是0.2~2.0 mmol/L; 靈敏度是6.36 μA/(mmol/L); 相關系數是0.999; 檢出限是0.3 μmol/L（S/N=3）。上述結果表明：Pt-nano能顯著提高傳感器的性能。

圖5 MWCNTs/Ptnano/GCE(a)和MWCNTs/GCE(b)修飾的傳感器的電流隨葡萄糖濃度的工作曲線及其線性相關點（略）

Fig.5 Linear correlation points of Calibration plots and I-c curves for the MWCNTs/Ptnano/GCE(a) and MWCNTs/GCE(b)

0.1 mol/L PBS (pH 6.4) at 0.5 V vs.Ag/AgCl．

與其它基于Sol-gel的的方法構建的L-乳酸傳感器〖16~18〗相對比，結果表明：本研究構建的L-乳酸傳感器具有較大的響應電流、較低的檢出限，表明Pt-nano結合MWCNTs提高了傳感器的電化學性能。

3.5 抗干擾性

在干擾物各自生理濃度水平上考察了其對L-乳酸響應的干擾。在0.5 mmol/L L-乳酸溶液中，對其含有的對乙酰氨基酚（0.13 mmol/L）、葡萄糖（5.45 mmol/L）、尿酸（0.35 mmol/L）、抗壞血酸（0.055 mmol/L）、半胱氨酸（0.015 mmol/L）進行檢測(見表1)。結果顯示：對乙酰氨基酚、葡萄糖、尿酸、抗壞血酸、半胱氨酸對L-乳酸的測定幾乎沒有影響。說明此傳感器具有很好的抗干擾能力。原因是MWCNTs/Sol-gel修飾的玻璃碳電極降低了H2O2氧化還原過電位。

表1 L-乳酸檢測中可能的其它底物的干擾(0.1 mol/L PBS pH 6.4) （略）

Table 1 Possible interferences from other substrates for L-lactate determination (0.1 mol/L phosphate buffer at pH 6.4)

電流比率(Current ratio)=IL+I/II。其中IL+I和IL分別為干擾物存在和無干擾物的情況下L-乳酸的響應電流(IL+I is the response current of L-lactate in the presence of interference.IL is the response current of L-lactate)。0.5 mmol/L L-乳酸(L-lactate).

3.6 傳感器的重復性和穩定性

用同一傳感器對0.5 mmol/L L-乳酸溶液連續檢測5次，相對標準差是0.4%；用5個傳感器對0.5 mmol/L L-乳酸溶液進行檢測，相對標準差是2.0%。以上結果表明，構建的傳感器具有很好的重復性。

每隔5 d測定一次傳感器對０．5 mmol/L乳酸溶液的響應值。當傳感器不用時，儲存在0.1 mol/L PBS溶液（pH 6.8）中，室溫放置。連續檢測4星期以后，傳感器的響應值仍保持在最大響應值的90%，表明此傳感器具有很好的穩定性。

3.7 人血樣中L-乳酸的臨床檢測

在最適條件下，應用此傳感器檢測人血樣中L-乳酸，對其實際應用性能進行評估，并將其與分光光度法進行對比，結果見表2。

表2 兩種方法對血樣中L-乳酸的檢測（略）

Table 2 Determination results of L-lactate in real serum using two methods

對結果進行t校驗： t＝0.09288； t0.05(11)= 1.7959； t＜t 0.05(11)， p＞0.05。

由以上結果可以看出，兩種方法測定結果無顯著差異。本傳感器對樣品的測定結果與分光光度法具有很好的一致性。