【摘要】 建立了納米顆粒探針檢測(cè)核糖體失活蛋白的方法。以聚苯乙烯納米顆粒為載體并進(jìn)行表面修飾，在其表面固定特異性蓖麻毒單抗并作為探針，用于蓖麻毒蛋白的檢測(cè)。采用場(chǎng)流分離技術(shù)對(duì)納米顆粒探針進(jìn)行準(zhǔn)確表征，并利用掃描電鏡比較聚苯乙烯納米顆粒的形貌變化。結(jié)果表明：通過掃描電鏡圖片能夠觀察到聚苯乙烯納米顆粒表面結(jié)合的蛋白，此納米顆粒探針能夠與蓖麻毒蛋白等核糖體失活蛋白的特異性結(jié)合，應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 納米顆粒探針; 蓖麻毒素; 核糖體失活蛋白; 場(chǎng)流分離; 掃描電鏡; 聚苯乙烯

1 引 言

核糖體失活蛋白(Ribosomeinactivating proteins， RIP)存在于許多植物中，植物核糖體失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病蟲害或者惡劣的環(huán)境[1]。根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，RIP 可以分成兩類：Ⅰ型，由一條多肽鏈組成;Ⅱ型，是雙鏈蛋白。Ⅱ型雙鏈RIP 由2條或者4條多肽鏈組成，分子量約為60 或120 kDa，其中一條是A (Active)鏈，具有N糖苷酶活性;另一條是B (Binding)鏈，這兩條鏈通過二硫鍵和非共價(jià)鍵連接[2，3]。蓖麻毒是一種典型的核糖體失活蛋白，由于蓖麻毒來源廣泛，禁止化學(xué)和生物武器公約把蓖麻毒列為最為嚴(yán)格的控制對(duì) [4，5]。因此，開展對(duì)蓖麻毒等核糖體失活蛋白的檢測(cè)研究具有重要意義[6～8]。目前，檢測(cè)核糖體失活蛋白的方法有免疫分析法和生物質(zhì)譜法[9～11]。納米材料因具有顆粒尺寸小、比表面積大、表面能高、表面原子所占比例大等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于蛋白檢測(cè)中[12，13]。場(chǎng)流分離(Field flow fractionation， FFF)是Giddings提出的一種新的分離分析理論[14，15]，它將流體與外加場(chǎng)聯(lián)合作用于樣品，實(shí)現(xiàn)樣品組分的分離。場(chǎng)流分離技術(shù)可分離提純、收集流體中范圍為0.02～1 μm的懸浮物顆粒， 也可作為一種表征技術(shù)對(duì)樣品中納米顆粒的質(zhì)量、密度、電荷及其它物理參數(shù)的準(zhǔn)確測(cè)定。場(chǎng)流分離技術(shù)根據(jù)外加場(chǎng)的不同，可分為沉降場(chǎng)、流體場(chǎng)、熱力場(chǎng)、電場(chǎng)和磁場(chǎng)等多種分支，其中沉降場(chǎng)流分離(Sedimentation field flow fractionation)技術(shù)較為完善且應(yīng)用較多[16，17]。

本研究建立了納米顆粒探針檢測(cè)核糖體失活蛋白的方法。以聚苯乙烯納米顆粒為載體，經(jīng)表面修飾后在其表面固定特異性單抗，利用沉降場(chǎng)流儀對(duì)納米顆粒探針進(jìn)行準(zhǔn)確表征，測(cè)量出單個(gè)聚苯乙烯納米顆粒結(jié)合的目標(biāo)分子數(shù)目，并利用掃描電鏡比較聚苯乙烯納米顆粒的形貌變化。通過掃描電鏡圖片能夠觀察到聚苯乙烯納米顆粒表面結(jié)合的蛋白，此納米顆粒探針能夠與核糖體失活蛋白的特異性結(jié)合，可應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

沉降場(chǎng)流分離儀(Postnova， UT， USA);Anton Paar DMA (60/602)振動(dòng)管密度計(jì)(奧地利Anto Paar公司); 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 (LEO 1550 EDS/OPAL/EBSD/STEM， Zeiss， Thornwood， USA); Sputter Coater SC7640 離子濺射儀(Quorum Technologies， UK); NAP5及NAP10凝膠滲透柱(通用公司); 5417C離心機(jī)(德國Eppendrof公司)。

蓖麻毒素A鏈(Ricin A Chain， 純度 98.99%)及其單抗IgG均由美國農(nóng)業(yè)部西部研究中心友情提供;聚苯乙烯納米顆粒 (240 nm，10%，w/V， Bangs Laboratories Inc. PA， USA);NH4HCO3 (>99.5%)、表面活性劑FL70(Fisher公司);實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水 (> 18 MΩ)。納米顆粒探針制備用試劑套裝(含聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(F108PDS)、3(2吡啶二巰基)丙酸N羥基琥珀酰亞胺酯 (SPDP)、二硫蘇糖醇(DTT)和磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)購自Sigma公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 離心沉降分離檢測(cè)技術(shù) 場(chǎng)流分離技術(shù)可視為一種單相的色譜技術(shù)，其系統(tǒng)設(shè)計(jì)為在超薄的樣品分離通道的垂直方向上引入一個(gè)可調(diào)控的外加場(chǎng)(如重力場(chǎng)、離心場(chǎng)等)[11～13]。含有納米顆粒懸浮液樣品在流動(dòng)相的作用下流過分離通道。當(dāng)樣品進(jìn)入通道后，樣品將暫停一段時(shí)間(即Relaxation time，停留注射或松弛步驟)。此時(shí)樣品中的不同組分由于物理性質(zhì)的差異， 在外加場(chǎng)的作用下，靠近通道壁的流體比中心處流得慢，不同質(zhì)量的納米顆粒在通道中的流速差別會(huì)導(dǎo)致其相應(yīng)的保留時(shí)間較大的差異，在流體及外加場(chǎng)的聯(lián)合作用下，樣品組分就得到了分離，沉降場(chǎng)流分離儀結(jié)構(gòu)[18]及分離原理如圖1所示。

分 析 化 學(xué)第38卷第5期全 燦等：納米顆粒探針檢測(cè)核糖體失活蛋白 圖1 (a)沉降場(chǎng)流分離儀結(jié)構(gòu)圖[18]和(b)沉降場(chǎng)流通道分離原理示意圖

Fig.1 (a) Structure diagram of the fieldflow fractionation(FFF) system[18]and (b) working principle scheme of FFF channel納米顆粒在尺度為940 mm×20 mm×0.254 mm的線型光滑通道中進(jìn)行，該通道的空隙保留體積為4.49 mL，死體積為0.439 mL，外加場(chǎng)為離心力場(chǎng)。檢測(cè)時(shí)將線型光滑通道置于離心場(chǎng)中隨離心機(jī)軸向旋轉(zhuǎn)，距離離心機(jī)軸的徑向距離為15.5 cm。流動(dòng)相為流速為1.5 mL/min的0.1% FL70溶液。樣品進(jìn)樣體積為10 μL，松弛時(shí)間為12 min以確保樣品在分離通道中平衡，離心機(jī)轉(zhuǎn)速500～2000 r/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm。聚苯乙烯納米顆粒的密度為1.053 g/cm3[19]。利用振動(dòng)管密度計(jì)測(cè)定0.1% FL70的流動(dòng)相密度為997.1 kg/m3 [20]。

2.2.2 納米顆粒表面修飾 利用修飾劑F108PDS對(duì)聚苯乙烯表面進(jìn)行修飾，并利用離心沉降分離儀進(jìn)行表征：按比例取適量修飾劑F108PDS (10 g/L)加入到聚苯乙烯納米顆粒懸浮液中，在一定條件下使聚苯乙烯顆粒表面物理吸附足夠量的修飾劑F108PDS，經(jīng)分離機(jī)離心分離未結(jié)合或結(jié)合不緊密的修飾劑F108PDS，棄去上清液后用磷酸鹽緩沖液重新稀釋納米顆粒，重復(fù)上述步驟3次并合并懸浮液渦旋混合，取10 μL納米顆粒懸浮液樣品進(jìn)行離心沉降分析。

2.2.3 蓖麻毒單抗表面修飾 利用修飾劑SPDP對(duì)蓖麻毒單抗進(jìn)行修飾，并利用離心沉降分離儀進(jìn)行表征：按比例取適量修飾劑SPDP 加入到蓖麻毒單抗溶液(2.0 g/L)中，在一定條件下反應(yīng)后，利用NAP5柱分離除去過量的修飾劑SPDP及一些小分子反應(yīng)產(chǎn)物，再加入適量修飾劑DTT，再利用NAP10柱分離除去過量的修飾劑DTT。

2.2.4 納米顆粒固定單抗 將端基化的抗體與經(jīng)表面修飾后的聚苯乙烯納米顆粒溫和反應(yīng)，離心除去未結(jié)合及結(jié)合松散的抗體上清液，用緩沖鹽再次懸浮并渦旋混合，再離心沉淀的納米顆粒，即得到具有特異性抗體修飾的納米探針顆粒，取10 μL納米探針顆粒懸浮液進(jìn)行FFF分析，測(cè)定其表面抗體結(jié)合的程度。

2.2.5 蓖麻毒蛋白的檢測(cè) 取5 μL蓖麻毒蛋白，加入到2.2.4節(jié)制備得到的納米顆粒探針中，恒溫反應(yīng)。取10 μL納米探針顆粒懸浮液進(jìn)行FFF分析，測(cè)定其表面抗體與蓖麻毒蛋白的結(jié)合程度。

2.2.6 掃描電鏡法 將固含率為1%的聚苯乙烯納米顆粒懸浮， 液滴在帶有碳膜的電鏡用銅網(wǎng)上，待懸浮液中的載液用氮?dú)獯蹈珊螅秒x子濺射儀進(jìn)行離子濺射鍍膜，最后將樣品放入電鏡樣品臺(tái)上進(jìn)行掃描電鏡觀測(cè)。 圖2 納米顆粒探針制備機(jī)理

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)機(jī)理

以聚苯乙烯納米顆粒為載體，經(jīng)表面修飾后在其表面固定特異性單抗，利用離心沉降場(chǎng)流儀對(duì)納米顆粒探針進(jìn)行準(zhǔn)確表征，測(cè)量出單個(gè)聚苯乙烯納米顆粒結(jié)合的目標(biāo)分子的數(shù)目，實(shí)驗(yàn)機(jī)理如圖2所示。由于聚苯乙烯納米顆粒比表面積大，在溶液中分散性好，本實(shí)驗(yàn)中納米顆粒的抗原包被、免疫反應(yīng)均在準(zhǔn)均相溶液中進(jìn)行，反應(yīng)更充分，反應(yīng)物用量更少，反應(yīng)更完全，可用于痕量、超痕量目標(biāo)分子的快速檢測(cè)。

3.2 沉降場(chǎng)流分離法

在2.2.1節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件下，聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場(chǎng)流分離譜圖如圖3所示，保留時(shí)間約為46 min。 圖3 聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場(chǎng)流分離譜圖

Fig.3 Fractogram from typical FFF analysis of bare polystyrene(PS) particles

利用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)測(cè)定納米粒徑的原理的報(bào)道較多，根據(jù)在外加力場(chǎng)作用下，不同質(zhì)量的納米顆粒在分離通道中具有不同的保留時(shí)間進(jìn)行分離。在一定實(shí)驗(yàn)條件下，通過測(cè)定的納米顆粒的保留時(shí)間Tr， 計(jì)算納米顆粒的水力學(xué)粒徑d， 如式(1)：R=V0/Vr=6λ[coth0.5λ-2λ](1)

Vr=TrF(2)其中，V0為分離通道空隙體積(Void volume)，Vr為一定粒徑的保留體積，F(xiàn)為流動(dòng)相流速，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的保留體積值，由式(1)計(jì)算出λ，同時(shí)λ=KT/[ma(1-ρc/ρα)Gw]=6kT/d3(ρa(bǔ)-ρc)πGw(3) 其中，d為聚苯乙烯納米顆粒的粒徑，k為玻爾茲曼常數(shù)(k=1.3806503×10-23)，T為實(shí)驗(yàn)溫度(K)， ρc為流動(dòng)相密度(997.1 kg/m3)， ρa(bǔ)聚苯乙烯納米顆粒的密度(1.053 g/cm3)，w為分離通道的厚度(0.0254 cm)， G為外加離心力場(chǎng)，由式(3)得出: G=2πv602×dc(4)其中v為離心機(jī)的轉(zhuǎn)速， dc為分離通道距離離心機(jī)軸的徑向距離，本儀器中為dc=15.5 cm。

由式(3)和式(4)可計(jì)算出粒徑d，經(jīng)多次重復(fù)測(cè)量，聚苯乙烯納米顆粒的粒徑為246 nm。

3.3 反應(yīng)條件的影響

實(shí)驗(yàn)研究了反應(yīng)條件的影響，考察反應(yīng)時(shí)間以及攪拌對(duì)納米顆粒表面修飾效果的影響。利用沉降場(chǎng)流分離儀進(jìn)行測(cè)定，保留時(shí)間越長(zhǎng)，表明聚苯乙烯納米顆粒的表面修飾效果越好。沉降場(chǎng)流分離譜圖如圖4所示。由圖4可知， 在24 h的反應(yīng)時(shí)間中，通過攪拌可以增強(qiáng)表面修飾效果，保留時(shí)間從46.9 min 增加到50.1 min。在表面修飾反應(yīng)過程中，不論是否攪拌，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間均有利于改善表面修飾效果，保留時(shí)間有顯著增大趨勢(shì);反應(yīng)6 d后進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間則無顯著性效果。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間選擇24 h，并伴隨攪拌。

圖4 聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場(chǎng)流分離譜圖

Fig.4 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles

A. 聚苯乙烯祼珠(Bare PS particles， RT=45.288 min); B. 1天沒有攪拌(1 Day without stiming， RT=46.860 min); C. 3天沒有攪拌(3 Days without stiming， RT=48.368 min); D. 7天沒有攪拌(7 Days without stiming， RT=53.556 min); E. 1天有攪拌(1 Day with stiming， RT=50.060 min); F. 6天有攪拌(6 Days with stiming， RT=54.220 min)。3.4 納米顆粒探針的準(zhǔn)確表征

圖5 聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場(chǎng)流分離譜圖

Fig.5 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles

A. Bare PS particles; B. F108; C. F108IgG; D. F108IgGRicin.制備得到的納米顆粒探針基體為聚苯乙烯納米顆粒、依次包被了F108PDS、蓖麻毒抗體以及蓖麻毒蛋白。圖5為聚苯乙烯納米顆粒及其經(jīng)過多層包被的沉降場(chǎng)流分離譜圖，各層的密度均大于沉降場(chǎng)流分離過程中流動(dòng)相的密度，各層吸附在聚苯乙烯納米顆粒上使其總質(zhì)量增大，表現(xiàn)為沉降場(chǎng)流分離過程中保留時(shí)間的延長(zhǎng)。

吸附各層的質(zhì)量可通過各自的保留時(shí)間計(jì)算，結(jié)果見表1。單個(gè)納米顆粒的粒徑為246 nm; 根據(jù)其密度可以計(jì)算出單個(gè)聚苯乙烯納米顆粒的質(zhì)量為9.4×10-18 g/PS; 根據(jù)吸附各層的質(zhì)量可計(jì)算出每個(gè)聚苯乙烯納米顆粒上結(jié)合約16510個(gè)F108PDS分子，923個(gè)IgG抗體分子和1665個(gè)Ricin 蛋白分子。表1 納米顆粒探針多層表面組成沉降場(chǎng)流分離計(jì)算結(jié)果

3.5 掃描電鏡法測(cè)定結(jié)果

圖6A和6B分別為聚苯乙烯納米顆粒及其結(jié)合了蛋白的掃描電子顯微鏡圖。圖6A可見清晰的球形聚苯乙烯納米顆粒，而圖6B則非常模糊，包被有其它物質(zhì)，且納米顆粒也略呈橢球型不規(guī)劃顆粒，表明聚苯乙烯顆粒在探針制備前后其形貌有顯著性變化。但鑒于儀器的分辨率限制，本實(shí)驗(yàn)中未能觀測(cè)到聚苯乙烯顆粒在探針制備前后納米顆粒粒徑的顯著性變化。

研究結(jié)果表明，研制的納米顆粒探針能夠與蓖麻毒蛋白等核糖體失活蛋白的特異性結(jié)合，可應(yīng)用于目標(biāo)蛋白檢測(cè)，對(duì)于痕量、超痕量的核糖體失活蛋白的檢測(cè)具有重要意義。