【摘要】 目的 制備苦參素(KU)納米球，研究其在大鼠體內(nèi)的分布。方法采用乳化溶劑揮發(fā)法制備苦參素-PLGA-納米球(KU-PLGA-NS)，建立高效液相色譜分析法，流動(dòng)相選擇0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-甲醇-三乙胺(20∶80∶0.009)，將36只大鼠隨機(jī)分為兩大組，每大組再分3小組，每小組6只，兩大組分別經(jīng)腹腔給藥苦參素原料藥和制備得到的苦參素納米球。通過檢測(cè)大鼠心、肝、脾等組織中的藥物濃度，評(píng)價(jià)其肝主動(dòng)靶向作用。結(jié)果制得苦參素-PLGA-NS平均粒徑 190.5 nm，平均包封率為 79.7% ，平均載藥量為20.5% 。與苦參素原料藥對(duì)照，苦參素納米球在肝組織中的藥物峰濃度明顯增加，20 min后達(dá)9.65 μg/ml。結(jié)論KU-PLGA-NS具有緩釋和肝主動(dòng)靶向作用。

【關(guān)鍵詞】 苦參素;乳酸-羥基乙酸共聚物;納米球

苦參素(kurarinone ，KU)又名氧化苦參堿，是從豆科植物苦豆草的種子苦豆子或豆科植物苦參的根中提取的一種生物堿，具有抗炎，抗病毒，免疫機(jī)制和抗腫瘤等作用，近年來發(fā)現(xiàn)它對(duì)病毒性肝炎亦有明顯治療作用[1，2]。納米給藥系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)靶向和緩釋給藥，以及提高難溶性藥物的生物利用度，降低藥物毒副作用等方面具有良好的應(yīng)用前景[3，4]。高分子材料乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycollic acid)，PLGA]，因其優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，被廣泛用作納米球(nanosphere，NS)的載體材料，以其為載體的NS克服了納米乳劑，納米脂質(zhì)體藥物易泄露等缺點(diǎn)，成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一，為一類新型的靶向給藥載體[5，6]。本實(shí)驗(yàn)以PLGA為載體，Pluronic F68為乳化劑，采用乳化溶劑揮發(fā)法[7]成功地制備了粒徑大小適中的KU-PLGA-NS，通過其在大鼠體內(nèi)的分布研究，探索其用于治療肝炎的可行性。

1材料與儀器

1.1儀器79-1型磁力攪拌器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，AG285型電子天平(瑞典METTLER TOLEDO 公司)，島津高效液相色譜儀(包括LC-20AB泵，SPD-M20A紫外檢測(cè)器及島津Lcsolution色譜工作站)，C18色譜拄(依利特)，超速冷凍離心機(jī)，納米粒徑分析儀(英國Malrern儀器公司)，JEOL型高分辨透射電鏡(日本電子珠氏會(huì)社)。

1.2藥品與試劑苦參素(陜西龍孚生物化工有限責(zé)任公司)PLGA(LA/GA=75/25，MW=8 600，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司)Pluronic F-68(西安羅森伯科技有限公司)，甲醇(色譜純)，丙酮，磷酸二氫鉀等其他試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：水相：0.5%pluronic F-68 稱取Pluronic F-68 0.5 g 溶于100 ml的純化水中。油相：精密稱取苦參素19.7 mg;PLGA(75/25)83.5 mg溶于5 ml丙酮中，備用。

2方法

2.1KU-PLGA-NS膠體溶液的制備取3 ml已配好的油相，將其用注射器針頭緩慢注入到以一定速度(以不起泡為宜)攪拌的100 ml Pluronic F-68 水相中，常溫下磁力攪拌除盡丙酮，攪拌時(shí)間以3 h為宜。經(jīng)0.25 μm微孔濾膜過濾即得苦參素-PLGA-NS膠體溶液。低溫避光保存。

2.2形態(tài)及粒徑觀察取KU-PLGA-NS膠體溶液適量，少量純化水稀釋后用1.5%(W/V)磷鎢酸負(fù)染色，滴于鍍膜的電鏡銅網(wǎng)上，晾干后，置于透射電鏡下觀 察納米球的外觀形態(tài)并拍攝照片。

2.3色譜分析條件色譜柱為hypersil ODS C18色譜柱(大連依利特公司150 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-甲醇-三乙胺(20∶80∶0.009);流速為1.0 ml·min-1;檢測(cè)波長為229 nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為20 μl。

2.4包封率、載藥量及利用率的測(cè)定精密吸取KU-PLGA-NS膠體溶液500 μl超速冷凍離心(45 000 r·min-1)2 h，精密吸取上清液20 μl，HPLC法測(cè)定苦參素含量。計(jì)算未包封苦參素的量(M1)，再精密吸取KU-PLGA-NS膠體溶液500μl，用一定體積的混合有機(jī)溶劑溶解苦參素和PLGA，測(cè)得苦參素的總量，計(jì)算膠體溶液中苦參素的含量(M2)，M(PLGA)為PLGA的投藥量，按下式計(jì)算包封率，載藥量和藥物利用率。包封率(%)=(M2-M1)/M2 ×100%載藥量(%)=(M2-M1)/M(PLGA) ×100%藥物利用率(%)=M2/投藥量 ×100%

2.5組織內(nèi)苦參素濃度的測(cè)定

2.5.1樣品處理將SD大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、皮膚、肌肉、脂肪、胸腺、骨髓、睪丸/子宮和腦等組織臟器分別稱取0.2 g，不足0.2 g的組織按實(shí)際重量稱取，吸干組織殘留血液，按1∶3比例定量加入生理鹽水研磨成勻漿，吸取200 μl，置于玻璃離心管中。骨髓取之于大鼠的股骨，剪刀剪斷股骨，用注射器吸1ml鹽水從股骨斷處將骨髓沖出，進(jìn)行勻漿加入200 μl 的1 mol/L NaOH堿化，渦旋混合30 s，加入乙酸乙酯2 ml，渦漩震蕩約45 s，2 000 r/min離心10 min，取有機(jī)層，重復(fù)1次，合并有機(jī)相，40℃氮?dú)獯蹈伞Ａ鲃?dòng)相重溶，轉(zhuǎn)移至EP管中，4 000 r/min離心10 min，20 μl進(jìn)樣?？疾旆椒ǖ膶傩?、線性范圍、精密度和回收率等。

2.5.2KU-PLGA-NS大鼠體內(nèi)分布研究根據(jù)新藥指導(dǎo)原則規(guī)定，將36只大鼠隨機(jī)分為兩大組，每大組再分3小組，每小組6只，兩大組分別經(jīng)腹腔給藥苦參素原料藥和苦參素靶向緩釋納米球，劑量均為6 mg/kg。于2，20 min和120 min上述時(shí)間點(diǎn)股動(dòng)脈放血處死大鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、皮膚、胸腺、腦、子宮、睪丸、骨髓、脂肪，取樣時(shí)要注意樣本的一致性和代表性，用生理鹽水沖去其表面污血，再用濾紙吸干表面的浮血，各組織除骨髓外均稱取實(shí)際重量，按1∶3(W/V)的比例加生理鹽水適量，將組織勻漿，骨髓取之于小鼠的股骨，用注射器吸1 ml生理鹽水從股骨處將骨髓沖出，進(jìn)行勻漿。吸取勻漿液200 μl置于玻璃離心管中，2 000 r/min離心10 min，取有機(jī)層，重復(fù)一次，合并有機(jī)相，40℃氮?dú)獯蹈?。流?dòng)相重溶，轉(zhuǎn)移至EP管中，4 000 r/min離心10 min，就可取上清液進(jìn)樣了。

3結(jié)果

3.1經(jīng)透射電鏡觀察分析納米球呈類球形，分布較均勻，電鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)納米球，得平均粒徑為190.5 nm，KU-PLGA-NS的透射電鏡照片如圖1。

3.2包封率及載藥量的測(cè)定結(jié)果制得KU-PLGA-NS平均包封率平均包封率為 79.7% ，平均載藥量為20.5% 。

3.3HPLC檢測(cè)苦參素的方法學(xué)考察

3.3.1方法專屬性在以上的實(shí)驗(yàn)條件下，生物樣品的內(nèi)源性物質(zhì)的色譜峰均對(duì)苦參素色譜峰無干擾，可以滿足生物樣品的快速準(zhǔn)確分析。結(jié)果見圖2。

3.3.2線性范圍在0.025~1μg/ml范圍內(nèi)，苦參素血漿濃度與色譜峰面積比線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y^=0.003 673X+0.044 481(r=0.999 7， P<0.05)(n=7)，最低檢測(cè)濃度0.01 μg/ml。圖1KU-PLGA-NS的透射電鏡照片a-空白血漿b-空白血漿+苦參素圖2空白血漿和空白血漿加藥色譜圖

3.3.3回收率和精密度回收率為92.1%~102.1%(n=5)。日內(nèi)和日間精密度均<6.5%(n=5)。

3.4肝組織中KU濃度測(cè)定結(jié)果圖3顯示兩種制劑經(jīng)腹腔注射給藥后，2 min時(shí)在肝中濃度幾乎沒有差別。20 min時(shí)KU-PLGA-NS制劑在肝中濃度明顯高于KU原料藥在肝中的濃度，是其1.55倍，說明KU-PLGA-NS制劑具有靶向性;120 min時(shí)，KU原料藥在肝中的濃度顯著下降，而KU-PLGA-NS制劑在肝中的濃度的下降幅度不時(shí)很大，說明KU-PLGA-NS制劑具有緩釋性。相同時(shí)間點(diǎn)KU組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3分別腹腔注射苦參素和苦參素納米球后不同時(shí)間大鼠肝中藥物濃度的比較

3.5苦參素原料和納米球在體內(nèi)分布情況如圖4和圖5所示，苦參素給藥后主要分布在肝臟，與KU相比，KU-PLGA-NS在體內(nèi)的分布發(fā)生了很大的變化，苦參素納米球在肝臟中濃度明顯增高，20 min后達(dá)9.65 μg/ml。

4討論

納米粒的制備方法有乳化溶劑揮發(fā)法、液中干燥法、天然高分子凝聚法、自動(dòng)乳化法、鹽析法等。本實(shí)驗(yàn)采用乳化溶劑揮發(fā)法制備KU-PLGA-NS，此法主要利用機(jī)械攪拌法制備載藥納米粒，工藝簡便且避免了一些如含氯等有機(jī)溶劑的使用，同時(shí)制得的KU-PLGA-NS的外觀圓整，粒徑可控制在50～200 nm范圍內(nèi)，且分散均勻，其包封率和載藥量也較高。本實(shí)驗(yàn)所采用的高分子材料乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycollic acid)，PLGA]，是由乳酸和乙醇酸以不同比例鑲嵌共聚而成的高分子納米材料，其兼有兩種聚酯材料的優(yōu)勢(shì)，如質(zhì)量穩(wěn)定，生物惰性，生物可降解性且降解速度可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，由于其優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，被廣泛用作納米球(nanosphere，NS)的載體材料，可延長藥物作用時(shí)間，從而達(dá)到靶向目的，提高藥物療效。圖4經(jīng)腹腔給藥苦參素原料藥(6 mg/kg)后藥物在各組織中分布圖5大鼠經(jīng)腹腔給藥苦參素納米球(6 mg/kg)后藥物在各組織中分布將制成的KU-PLGA-NS制劑通過腹腔注射給藥后，測(cè)得大鼠各組織藥物濃度，發(fā)現(xiàn)藥物在肝中的濃度明顯高于以苦參素原料給藥后在肝中的濃度，同時(shí)在其它組織中的濃度相對(duì)較低，使苦參素在肝位的濃度大大提高，提高肝位病灶的治療效果以及降低對(duì)于肝外組織與器官的毒副作用有著重要意義。此外KU-PLGA-NS還顯示出一定的體內(nèi)緩釋作用。這種體內(nèi)緩釋作用更有利于藥物持續(xù)發(fā)揮作用，對(duì)藥物入肝、減輕毒副作用具有重要意義。