作者：王冰水易南李玲馬虹王建波王虹

【關(guān)鍵詞】 激光

關(guān)鍵詞: 激光;大鼠;脊髓;降鈣素基因相關(guān)肽

摘 要:目的 研究10mW氦氖（He-Ne）激光照射對大鼠坐骨損傷神經(jīng)后脊髓CGRP表達(dá)的影響. 方法 96只SD大鼠制成坐骨神經(jīng)損傷模型，He-Ne激光照射損傷的坐骨神經(jīng)，免疫組化方法觀察脊髓內(nèi)CGRP的變化. 結(jié)果 神經(jīng)損傷后1d脊髓內(nèi)CGRP表達(dá)即增加;2wk及4wk時(shí)激光照射組CGRP的表達(dá)高于對照組，陽性表達(dá)主要存在于脊髓灰質(zhì)內(nèi)前角運(yùn)動神經(jīng)元和背根感覺纖維;8wk時(shí)CGRP仍保持較高水平的表達(dá)，二組無明顯差異. 結(jié)論 10mW He-Ne激光照射大鼠損傷的坐骨神經(jīng)可引起脊髓內(nèi)神經(jīng)元CGRP表達(dá)的變化，有促進(jìn)完成神經(jīng)再生的作用.

Keywords:laser;rat;spinal cord;calcitonin gene-related peptide

Abstract:AIM To study the expression of calcitonin gene-related peptide（CGRP）in spinal cord after irradiation on in-jured sciatic nerve of rat by He-Ne laser with output power of10mW.METHODS Injured sciatic nerves，made in96SD rats，were irradiated by He-Ne laser.The changes of CGRP in spinal cord were immunohistochemically studied.RE┐SULTS Expression of CGRP increased in spinal cord on the first day after injury of sciatic nerve.More expression ofCGRP in second and fourth week was observed in laser irradi-ation group compared to control group.The positive sub-stance was mainly found in motor neuron in anterior horn and sensory nerve fiber in posterior horn.At eighth week，CGRP remained a high expression in both groups，and showed no significant difference.CONCLUSION Expression of CGRP in spinal cord can be changed by He-Ne laser irradiation with power output of10mW on injured sciatic nerve in rat.He-Ne laser irradiation can promote nerve regeneration.

0 引言

He-Ne激光有廣泛的生物學(xué)作用，動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證實(shí)激光照射有促進(jìn)外周神經(jīng)生長的作用［1］ ，其作用機(jī)制尚待探討.降鈣素基因相關(guān)肽（cal-citonin gene-related peptide，CGRP）是由37個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)多肽［2，3］ ，起著遞質(zhì)或細(xì)胞外調(diào)節(jié)物樣作用，由降鈣素基因家族編碼，但化學(xué)結(jié)構(gòu)、體內(nèi)分布及生物活性不同于降鈣素，主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中［4］ ，具有舒血管作用，在神經(jīng)再生過程中起一定作用［5］ .我們觀察了He-Ne激光照射損傷大鼠坐骨神經(jīng)后脊髓CGRP表達(dá)的變化.

1 材料和方法

1.1 動物模型及照射方法 SD成年雄性大鼠96只，體質(zhì)量（250±20）g，10g L -1 戊巴比妥鈉（30mg kg

-1 ，ip）麻醉，常規(guī)消毒，取右側(cè)股后外側(cè)暴露坐骨神經(jīng)，于神經(jīng)分叉上0.7cm處眼科剪剪斷，并修剪神經(jīng)斷端的覃狀頭，原位吻合以9個(gè)0的絲線縫合神經(jīng)外膜4～6針，吻合后創(chuàng)口內(nèi)放入慶大霉素2萬單位關(guān)閉創(chuàng)口，對等分激光照射組和對照組各48只處理.He-Ne激光器（西安產(chǎn)）波長632.8nm，激光照射組照射功率為10mW，每次使用前激光功率計(jì)檢測激光器的功率輸出.照射時(shí)光斑直徑0.6cm，功率密度為35.39mW cm-2 ，對準(zhǔn)神經(jīng)吻合處每次照射10min，照射能量密度為21.23J cm-2 ，對照組做相同處理，激光照射功率輸出為0mW，每日1次，連續(xù)10d.

1.2 免疫組織 分別從照射1d開始，于照射前、照射后1，3d，1，2，4，6和8wk，照射組和對照組各取6只大鼠，10g L-1 戊巴比妥鈉2mL，ip，待大鼠麻醉后，依次剪開胸腔、右心房、心室，而后剪開左心室，將輸液管通過左心室插入主動脈內(nèi)，生理鹽水快速灌注150mL，40g L-1 多聚甲醛快速灌注200mL，緩慢滴注300mL，持續(xù)1.5～2h，而后取坐骨神經(jīng)及相應(yīng)脊髓，浸入200g L-1 蔗糖液（0.01mol L-1 PB）4℃過夜，恒冷箱切片，片厚30μm.用0.01mol L-1 PBS清洗10min×3→浸入含3g L-1 Triton×100的0.01mol L -1 PBS30min→0.01mol L

-1 PBS清洗10min×3→加羊抗CGRP（1 2000，Sigma）4℃孵育48h，取出入0.01mol L-1 PBS清洗10min×3→加入兔抗羊抗體（1 200，Sigma）室溫孵育2h→入0.01mol L-1 PBS清10min×3→浸入ABC復(fù)合物（1 500，Sigma）室溫孵育2h，浸洗硫酸鎳胺加強(qiáng)的DAB藍(lán)色反應(yīng)法顯色、貼片、干燥、脫水、透明、中性樹膠封片.應(yīng)用Leica Q570c真彩色圖像分析儀（德國），進(jìn)行灰度定量分析，每張切片在損傷側(cè)后角的第3，4板層選5個(gè)高倍視野進(jìn)行陽性物質(zhì)密度值測定，取測定數(shù)值減去背景測定數(shù)值的絕對值，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析.

圖1 － 圖2 略

2 結(jié)果

成年大鼠腰骶段脊髓中CGRP陽性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目較少，每一切面多為有1～2個(gè)CGRP陽性反應(yīng)細(xì)胞，均為前角運(yùn)動神經(jīng)元，染色較淡，無明顯陽性纖維，陽性反應(yīng)細(xì)胞多為大細(xì)胞，呈圓形或多角形，樹突較短，陽性物質(zhì)主要集中在胞質(zhì)，胞核為陰性.坐骨神經(jīng)損傷后1d即發(fā)現(xiàn)損傷側(cè)CGRP陽性反應(yīng)增強(qiáng)，1wk以內(nèi)激光照射組和對照組無明顯差異，此時(shí)神經(jīng)元突起明顯，少量神經(jīng)元間有較長的陽性纖維，后角CGRP陽性反應(yīng)纖維較多.2wk時(shí)激光照射組CGRP陽性反應(yīng)較對照組更明顯，前角運(yùn)動神經(jīng)元陽性個(gè)數(shù)明顯多于對照組（Fig1A，1B），細(xì)胞陽性染色較重，集中在胞質(zhì)，胞體突起較多，有的細(xì)胞有較長的CGRP陽性纖維向外伸展，未損傷側(cè)前角運(yùn)動神經(jīng)元陽性個(gè)數(shù)也少量增加.損傷側(cè)后角陽性纖維排列密集，走形較雜亂，纖維上有較多的CGRP陽性膨體，呈串珠狀（Fig2A，2B），脊髓后角第3，4脊髓板層內(nèi)損傷側(cè)CGRP反應(yīng)陽性的灰度值測定（Tab1），顯示第2，4周時(shí)激光照射組高于對照組（P<0.01），第6周時(shí)仍保持較高水平，第8周時(shí)激光照射組與對照組已無明顯差異，但均高于正常水平.

表1 脊髓后角CGRP陽性反應(yīng)的灰度值略

3 討論

He-Ne激光是波長632.8nm的相干光，有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，作用于生物組織可使生物膜分子構(gòu)象發(fā)生改變，改變膜受體結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞活性發(fā)生變化，有明顯的生物學(xué)刺激作用［6］ . 神經(jīng)修復(fù)是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，外周神經(jīng)元損傷后可產(chǎn)生一系列的化學(xué)和組織學(xué)變化，一般認(rèn)為，在這種變化中，與神經(jīng)遞質(zhì)代謝有關(guān)的酶蛋白的合成下調(diào)，而與軸突存活和修復(fù)有關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白的合成增加，如神經(jīng)生長因子（NGF）［7］ 和生長相關(guān)蛋白（GAP-43）［8］ 的表達(dá).外周軸突損傷后，可導(dǎo)致CGRP在運(yùn)動神經(jīng)元中含量增高，而He-Ne激光作為一種外界物理因子，通過其生物刺激作用使脊髓內(nèi)CGRP表達(dá)增高.激光照射組2wk時(shí)前角運(yùn)動神經(jīng)核團(tuán)CGRP陽性反應(yīng)較對照組更強(qiáng)烈，陽性細(xì)胞數(shù)目明顯多于對照組，激光照射組的后角陽性神經(jīng)纖維密集，數(shù)量多，染色重，較對照組陽性物質(zhì)明顯增多.神經(jīng)元產(chǎn)生的CGRP作為一種信號作用于膠質(zhì)細(xì)胞，觸發(fā)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞間的反應(yīng)，從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活與修復(fù)再生.另有研究發(fā)現(xiàn)CGRP對神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的營養(yǎng)作用，運(yùn)動神經(jīng)元疾病的脊髓和腦細(xì)胞核中CGRP免疫反應(yīng)明顯降低［9］ ，也提示了CGRP對神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)作用.一般認(rèn)為膠質(zhì)細(xì)胞上存在CGRP受體［10］ ，而CGRP可能是神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞間作用的一種調(diào)質(zhì)，CGRP首先與膠質(zhì)細(xì)胞上的受體結(jié)合，刺激膜上的cAMP合成增生，進(jìn)而激活c-fos基因的表達(dá)，c-fos基因又可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的纖維酸性蛋白（GFAP）的基因表達(dá)，促進(jìn)GFAP的合成，膠 質(zhì)細(xì)胞還能形成或分泌NGF，促軸突因子、胰島素生長因子（IGF）等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，這些因子能促進(jìn)中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)軸突的生長和存活，在神經(jīng)修復(fù)再生過程中起重要作用.

完整的神經(jīng)元和外周組織分別對CGRP的合成產(chǎn)生正反饋和負(fù)反饋?zhàn)饔?正常情況下，它們處于一種平衡狀態(tài)，當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，失神經(jīng)支配的肌肉組織失去了對CGRP合成的抑制作用，而致神經(jīng)元中CGRP合成增多，有利于神經(jīng)的再生.CGRP是強(qiáng)烈的血管舒張因子［11］ ，CGRP的增多可增加損傷運(yùn)動神經(jīng)元和軸突的血液供應(yīng)，亦有利于神經(jīng)的再生，但CGRP的舒血管作用機(jī)制尚未明確.另外，CGRP有明顯抗缺血及抗自由基損傷的保護(hù)作用，在神經(jīng)再生中亦不可忽視.激光照射后未損傷側(cè)脊髓內(nèi)CGRP陽性反應(yīng)細(xì)胞亦明顯增多，激光照射治療后機(jī)體可有整體效應(yīng)，其機(jī)制需進(jìn)一步探討.坐骨神經(jīng)損傷后1d脊髓內(nèi)CGRP水平即增高，1wk達(dá)到較高水平，而第8周時(shí)大部分大鼠的肢體功能包括肌力、展趾功能基本恢復(fù)時(shí)，CGRP仍有較高水平的表達(dá)，說明CGRP是神經(jīng)修復(fù)過程中較為敏感的因素，對神經(jīng)損傷及外周物理因子的刺激反應(yīng)較為敏感.神經(jīng)損傷早期，激光照射組與對照組之間無明顯差異，而第2周到第4周激光照射停止后，激光照射組CGRP表達(dá)明顯高于對照組，說明神經(jīng)損傷早期，損傷本身的刺激在CGRP表達(dá)中占主導(dǎo)作用，而激光照射作為外界物理因子刺激起次要作用.隨著時(shí)間延長，物理因子刺激逐漸發(fā)揮主要作用，激光照射組第4wk時(shí)CGRP仍有較高的表達(dá)說明激光照射停止后其生物學(xué)刺激作用仍然存在.CGRP的調(diào)控非常復(fù)雜，它的基因前體選擇性剪接的不同，在不同組織中表達(dá)為降鈣素（CT）或CGRP，低功率激光作為一種物理因子刺激可改變CGRP的表達(dá)，但其在CGRP調(diào)控中的作用尚需進(jìn)一步研究.

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