作者：王洪江 柳婷 謝躋 粟婉媛 郭愛玲 蔡朝霞

【摘要】 以CdCl2和Na2S為原料，以巰基乙酸為穩定劑，采取水相合成方法制備了CdS量子點。結果表明，合成CdS量子點最佳條件是：作用時間3 h，[Cd2+]∶[S2-]為2∶1， 50 μL穩定劑，pH 8.0，反應溫度30 ℃。通過EDC·HCl和NHS的作用，成功地將單增李斯特菌抗體IgG與CdS量子點偶聯。偶聯后的IgGCdS熒光強度顯著增強，為偶聯前的4倍。血清凝集反應和直接免疫熒光實驗證明，偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體的特性沒有發生變化，在熒光顯微鏡下可快速靈敏地檢測出單增李斯特菌。本方法特異性強、穩定性和重復性高，可用于食品中致病菌的快速檢測。

【關鍵詞】 量子點;單增李斯特菌;偶聯;熒光強度

1 引 言

CdS為ⅡⅥ型量子點，是常見核殼型量子點的主要組成部分[1]。CdS量子點具有良好的光學性質，合成發射不同顏色熒光的水溶性CdS量子點對于多色生物標記和核殼型量子點合成具有重要意義。有關CdS量子點的制備的研究較多[2～5]，且多采用化學液相法。該方法具有反應條件溫和、易控制，可制得組成均勻、純度高的納米材料等優點。

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)是一種能使人和動物患腦膜炎、敗血癥以及流產等疾病的致病菌，死亡率極高。檢測單增李斯特菌的常規方法雖然準確性好，但所需時間長，操作繁瑣，不能滿足當前食品安全快速檢測的要求。分子生物學方法快速、靈敏、特異性強，但成本較高，且要求較高的技術水準;大型儀器分析方法[6] 如VITEK(全自動細菌鑒定/藥敏系統)、MIS(微生物鑒定系統)等，雖然快速準確、檢測量大，但儀器費用頗高，一般檢測單位和食品企業不具備這種條件;免疫學中ELISA方法，操作簡便、快速、靈敏，因而廣泛應用于致病菌的檢測。

本研究利用納米材料的光學性質和免疫學反應的特異靈敏性，進行了CdS量子點與單增李斯特菌抗體偶聯的研究，對單增李斯特菌進行了快速檢測。本方法適用于食品安全的致病菌快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

DF101S智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海東璽制冷儀器設備有限公司); UV1700紫外分光光度計、RF5301熒光分光光度計(日本Shimadzu公司); JEM2010透射電子顯微鏡(日本JEOL LTD公司)、Nikon 80i熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

單增李斯特菌抗體(本實驗室制備); 巰基乙酸(TGA)、硫代乙酰胺(TAA)、CdCl2·2.5H2O、Na2S·9H2O和KOH(分析純，國藥集團); N羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1乙基(3二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl， 分析純，上海晶純試劑有限公司)。水為去離子水。

2.2 CdS量子點的合成及條件優化

參照并改進文獻[7]的方法，合成CdS量子點。在一定溫度下，在100 mL三口燒瓶中加入50 mL 去離子水和1 mL 0.0585 mol/L CdCl2溶液，充氮氣除氧20 min后加入TGA，調節pH值，繼續充氮氣除氧10 min后加入1mL 0.0585 mol/L Na2S溶液，繼續通氮氣除氧密閉攪拌后即得水溶性CdS量子點溶膠。稀釋后測其紫外可見吸收光譜和熒光發射光譜。按表1所列條件合成CdS量子點。表1 CdS量子點合成的反應條件

2.3 CdS量子點的表征分析

(1)透射電子顯微鏡(TEM)表征分析：取少量CdS溶液，用于TEM觀察; (2)紫外吸收分析：取少量CdS溶液進行紫外掃描分析，掃描波長范圍為200～600 nm; (3)熒光光譜分析： 將CdS量子點溶液進行熒光光譜掃描。掃描范圍220.0～800.0 nm，激發波長： 350.0 nm，激發狹縫： 5.0 nm， 發射狹縫： 5.0 nm。

2.4 CdS量子點與單增李斯特菌抗體IgG偶聯

參照并改進文獻[8]的方法。取水溶性量子點/磷酸鹽緩沖液30 μL，加入20 μL 60 g/L EDC·HCl溶液，振蕩混勻，再加入100 μL 0.15 g/L NHS 溶液，20 ℃溫和攪拌0.5 h，在持續攪拌下與含0.14 mg單增李斯特菌抗體IgG 的磷酸鹽緩沖溶液混合、密閉，20 ℃繼續攪拌0.5 h。

2.5 偶聯CdS量子點單增李斯特菌抗體的特性測定

(1)血清凝集實驗：在潔凈載玻片上滴加一滴偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體溶液后，加適量的單增李斯特菌菌體抗原，輕輕晃動載玻片使二者混勻，觀察載玻片上是否有凝集的細小顆粒。待載玻片上的反應物自然干燥后用熒光顯微鏡觀察。(2)直接熒光免疫實驗：在潔凈載玻片上滴加適量的單增李斯特菌滅活抗原，自然干燥，在-20 ℃用丙酮固定10～15 min，加偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體溶液，37 ℃溫育1 h，取出玻片用蒸餾水洗滌，再經0.1%伊文氏蘭染色、洗滌，完全干燥后在熒光顯微鏡下進行檢測。

3 結果與討論

3.1 CdS量子點的表征分析

本實驗制備的CdS量子點在TEM下觀察(圖1)以單分散形式存在，分散性良好，顆粒均勻呈球形，直徑約5 nm;UVvis分析(圖2)表明，在400 nm處有較強的吸收峰。

圖1 CdS量子點的透射電子顯微鏡照片

Fig.1 TEM photograph of CdS QDs 圖2 CdS量子點的紫外吸收光譜

Fig.2 UVvis absorption spectrum of CdS QDs3.2 反應時間對量子點粒徑和熒光光譜的影響

隨著制備量子點反應時間延長，CdS量子點的紫外吸收產生逐漸紅移現象。量子點的制備反應時間對量子點的熒光強度有一定影響。當反應時間為3 h時，合成CdS量子點的熒光強度最強;反應時間為1 h時，CdS量子點的熒光強度最弱;當反應時間為2， 4和5 h時，合成CdS量子點的熒光強度比較接近，處于中等水平。

3.3 [Cd2+]與[S2-]比例對制備CdS量子點的影響

合成CdS量子點的[Cd2+]與[S2-]的比例不同， 其紫外吸收曲線也有差異。當[Cd2+]∶[S2-]=1∶1和2∶1時，在400 nm處有較強的紫外吸收峰;當[Cd2+]∶[S2-]=1∶2時，在430 nm處有較強的紫外吸收，量子點的紫外吸收曲線很明顯地發生了紅移。

由表2可知，當[Cd2+]∶[S2-]的比例不同時，制備的CdS量子點熒光強度也有很大差別。當[Cd2+]∶[S2-] =2∶1時， CdS量子點熒光強度最大，約為[Cd2+]∶[S2-]=1∶2的13倍，[Cd2+]∶[S2-]=1∶1的5倍; 當[Cd2+]∶[S2-]=1∶2時，CdS量子點的熒光吸收峰發生明顯紅移效應。Cd2+過量更易得到粒徑小、熒光強度高的CdS量子點。這是由于Cd2+、S2-等在粒子表面發生了復雜的吸附作用。根據Fajans規則[9]，構晶離子將優先吸附在粒子表面。CdS 量子點表面通過靜電吸附這種配合物起到穩定作用。而S2-過量時，不能形成這樣的包覆層。 表2 [Cd2+]∶[S2-]不同比例制備的CdS量子點熒光強度

3.4 穩定劑對CdS量子點的影響

膠體法制備量子點常用的穩定劑有六偏磷酸鈉(HMP)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)[10，11]及TGA等巰基類化合物[12]。本實驗以TGA為穩定劑。隨著穩定劑含量的增加，CdS量子點紫外吸收曲線發生紅移。由表3可知，添加不同體積TGA，合成的CdS量子點在550 ～600 nm之間有熒光吸收，但熒光強度有很大的影響。加入50 μL TGA制備的CdS量子點熒光強度最強，約是加入100和150 μL TGA的6倍和18倍。表3 不同體積巰基乙酸制備的CdS量子點熒光強度

由表4可知，當體系中的pH值升高時，量子點的熒光吸收略微出現紅移，而熒光強度則急劇降低。結果表明，在pH 8時，CdS量子點的熒光強度最強，約是pH 9和pH 10時的14倍和22倍。隨著pH值降低，CdS 量子點的熒光逐漸增強。這是由于在較低的pH下，粒子表面高度質子化的硫化鈉分子減少了粒子間的氫鍵作用且使粒子ξ電位增加[13]，從而提高了粒子的分散性。表4 不同pH 條件下制備的CdS量子點熒光強度

3.5 溫度對合成CdS量子點的影響

在40 ℃下，制備的CdS量子點在400 nm處有較強的紫外吸收，在30 ℃和50 ℃條件下制備的CdS量子點紫外吸收發生紅移。當制備量子點的溫度升高時，量子點的熒光吸收峰逐漸紅移。如表5所示，反應溫度越低，生成量子點的顆粒越小，對應的熒光發射峰波長越小;反之，溫度越高，生成量子點的顆粒越大，對應的熒光發射峰波長越大。當反應溫度為30 ℃時，其熒光吸收峰在560 nm處;反應溫度為40 ℃時，其熒光吸收峰在590 nm處;如果將反應溫度升到50℃，其熒光吸收峰轉移到700 nm附近。量子點的熒光強度隨著溫度的升高有所降低，30 ℃時合成的量子點熒光強度最強，40 ℃和50 ℃時合成的量子點熒光強度較為接近，但均比30 ℃時弱。表5 不同溫度條件下制備的CdS量子點熒光強度

3.6 CdSIgG的表征分析

由圖3可見，偶聯單增李斯特菌抗體IgG的CdS量子點仍以單分散形式存在，形態均勻、呈球形，粒徑大小約為8 nm，較CdS量子點稍大。

單增李斯特菌抗體IgG的紫外吸收光譜(圖4)顯示，在280 nm處出現的強吸收峰，為蛋白質的特征吸收峰。CdSIgG偶聯后只在410 nm處有較強的紫外吸收峰，而蛋白質特征吸收峰則消失。

Fig.4 UVvis absorption spectrum of antibody IgG如圖5所示，在682～715 nm處CdS量子點和抗體IgG蛋白以及偶聯后的CdSIgG均有熒光吸收峰，其中CdS量子點的熒光強度比IgG蛋白略高。但經過偶聯后，CdSIgG的熒光強度明顯增強，約是單獨存在時的4倍。IgG偶聯的CdS量子點熒光光譜與偶聯前水溶性量子點相比，發射波長(λem)幾乎沒有變化，說明CdSIgG保持了原有水溶性量子點的熒光發射特性。

圖5 CdS量子點、IgG抗體和CdSIgG熒光光譜

3.7 偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體特性的測定

3.7.1 血清凝集實驗 對偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體進行血清凝集實驗發現，在抗體與抗原接觸混勻后約30 s，肉眼可清晰看見有固體小顆粒形成，說明抗原與抗體發生了凝集反應，偶聯量子點后的抗體性質沒有發生變化。在對反應樣品進行熒光顯微鏡鏡檢時，可清楚地看到凝集成團的菌體表面有熒光出現(圖6)。

3.7.2 直接熒光免疫實驗 用直接免疫熒光實驗對單增李斯特菌進行檢測結果顯示，加入有熒光CdS量子點標記的單增李斯特菌抗體反應后，載玻片上的菌體有特異性黃綠色熒光出現(圖7)。

圖6 血清凝集實驗顯微鏡照片(a)和熒光顯微鏡照片(b)

Fig.6 Microscope photograph(a) and fluorescence microscope photograph(b) of SAT圖7 直接免疫熒光實驗顯微鏡照片(a)和熒光顯微鏡照片(b)

Fig.7 Microscope photograph(a) and fluorescence microscope photograph(b) of direct immunofluorescence4 結 論

通過EDC·HCl與NHS的作用，使單增李斯特菌抗體IgG與CdS量子點偶聯穩定，體系的熒光峰位置沒有發生變化，但熒光強度顯著增強，偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體的熒光強度是偶聯前的4倍。結果證明： 巰基能與硫化鎘產生較強的相互作用。當修飾劑與硫化鎘作用加強時，會導致硫化鎘納米微粒的熒光強度增強，這與文獻[14]報道的結果一致。通過血清凝集反應和直接免疫熒光實驗證明，偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體的特性沒有發生變化，在熒光顯微鏡下可快速靈敏地檢測出單增李斯特菌。由于偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體熒光強度顯著增強，只要樣品中有極少量的單增李斯特菌在熒光顯微鏡下就會被抗體捕獲到并發出熒光。