作者：戴麗冰，鄒海燕，葉春婷，白利明，楊小紅，沈雁，陳鴻輝，譚見容

【摘要】 探討聚乙烯醇（PVA）紡絲纖維編織用I型膠原膠（COL-I）表面修飾后，構建組織工程前交叉韌帶（ACL）支架材料的可行性。用PVA紡絲編織成條束狀支架材料，用NIH-3T3細胞株和人前交叉韌帶（HACL）細胞分別種植到PVA和經(jīng)COL-I修飾過的PVA紡絲纖維編織（PVA/COL）支架材料上，立體培養(yǎng)。通過掃描電子顯微鏡對比評價材料經(jīng)I型膠原膠表面修飾前后NIH-3T3細胞株和HACL細胞在紡絲編織材料上細胞附增殖情況；在電子拉力機上測試PVA紡絲纖維編織支架材料的力學性能。結(jié)果表明：NIH-3T3細胞株和HACL細胞在PVA和PVA/COL支架材料表面和孔隙內(nèi)黏附增殖并分泌細胞外基質(zhì)，在PVA/COL支架材料上細胞黏附數(shù)量明顯增多； COL-I可促進NIH-3T3細胞株分泌細胞外基質(zhì)，但對HACL細胞作用不明顯。拉力測試該編織材料柔韌性強，最大負荷、極限應力和彈性模量分別為52.61 N、14.96 Mpa和202.08 Mpa。說明I型膠原可促進NIH-3T3細胞株和HACL細胞在聚乙烯醇紡絲纖維編織支架材料表面和孔隙內(nèi)黏附、增殖，可促進NIH-3T3細胞株分泌細胞外基質(zhì)。聚乙烯醇紡絲纖維編織材料具有一定的力學性能和細胞相容性，有望成為一種組織工程前交叉韌帶支架材料。

【關鍵詞】 聚乙烯醇；紡絲編織；I型膠原；前交叉韌帶；組織工程

Abstract：To investigate the application feasibility of PVA scaffold modified by COL-I to construct anterior cruciate ligament tissue engineering.Braide stripe scaffold with PVA spinning collagen waving.NIH-3T3 cell line and human anterior cruciate ligament cells(HACL) were cultured and expanded in vitro and they were seeded into the scaffold which was braided with PVA， and PVA was modified by COL-I(PVA/COL). The growth situation of seeded cells into the scaffold was observed under the scanning electron microscope(SEM)，the mechanical properties of the scaffold was tested with the electronic tensioner.Results showed that the porous structure of the scaffold facilitated the attachment and proliferation of NIH-3T3 cell line an HACL cells， and extracellular matrix was secreted. Cells adhered and spreaded better on the PVA/COL scaffold than on the PVA materials. COL-I could promote NIH-3T3 cell line to secrete extracellular matrix ，but no obvious effect on HACL was found. Pull tests showed that the flexibility of the material was strong，the peak load was 52.61N，the ultimate stress and elastic modulus was 14.96 Mpa and 202.08 Mpa respectively.COL-I could promote the attachment and proliferation of NIH-3T3 cell line and HACL cells，it also can promote NIH-3T3 cell line to secrete extracellular matrix， the scaffold braided with PVA/COL provide with good mechanical properties and biocompatibility，it is hopeful to become a useful scaffold in anterior cruciate ligament tissue engineering.

Key words：Polyvinyl alcohol; Spinning braiding; Type I collagen; Anterior cruciate ligament; Tissue engineering

1 引 言

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）的斷裂一般難以自愈，目前主要的治療方法是自體或異體移植物和人工合成材料進行ACL重建。自身供體存在來源有限、供區(qū)并發(fā)癥等問題。異體移植存在免疫排斥和疾病傳播的風險且也受存在來源限制。無活性的各種人工合成替代材料重建ACL遠期療效還存在爭議，限制了其臨床應用。組織工程技術的發(fā)展和應用為ACL重建提供了新的思路和途徑。

I型膠原蛋白是一種具備生物活性的大分子物質(zhì)，是細胞外間質(zhì)的主要成分。它與細胞的增生、分化以及眼球的潤滑、折光率等有著密切的關系，對傷口愈合、血液凝固起著重要的作用。膠原分子結(jié)構的不對稱性和大量親水基團的存在，使之具有高度的黏附性和親水性。在細胞遷移時能起支持和潤滑作用，還可誘導產(chǎn)生趨化因子如血小板生長因子和纖連蛋白等，從而對細胞的生長有趨化作用［1］。此外，膠原蛋白體內(nèi)應用不僅具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性，還具有藥物緩釋的功能。因此，膠原蛋白作為一種安全的醫(yī)用生物材料已廣泛用于科研和臨床，美國食品藥物管理局（FDA）已批準其作為人工皮膚的材料［2-3］。

本實驗擬用聚乙烯醇（polyviny alcohol，PVA）紡絲纖維編織構建韌帶支架材料，并用I型膠原膠進行表面修飾，觀察膠原膠是否能促進NIH-3T3細胞株、人ACL細胞(Human ACL，HACL細胞）在編織材料上黏附增殖，并對其力學性能進行測試。

2 材料和方法

2.1 材料

I型膠原蛋白膠為廣州市創(chuàng)傷外科研究所研制的膠原膠制劑。（取大鼠尾筋腱用酸溶解法提取I型膠原［4］，膠原提取液透析純化為膠原膠，經(jīng)雙縮脲試驗、凱氏定氮試驗、氨基酸成分分析、SDS-PAGE電泳、羥脯氨酸含量、紫外光譜最大吸收峰max≌226 nm、奧氏黏度計比黏度試驗η=50±10、pH=5.5±0.1、蛋白濃度（3±0.2）g/L，證明確屬I型膠原蛋白。膠原蛋白的商業(yè)性提取方法已獲得美國專利登記NO.2979438.1961）。

2.2 主要試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagles medium）Gibco（USA）；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶(Corning，USA)；6孔細胞培養(yǎng)板(Corning，USA)；NIH-3T3細胞株，PVA紡絲纖維(上海東華大學材料科學與工程學院)；0.2-200 μL微量加樣器(Nipar，Japan)；光學顯微鏡（ECLIPSE E400，Nikon Japan）；倒置顯微鏡（IMP-2 OLMPUS，Japan）；自動平衡離心機（LDZ4-0.8，北京離心機廠)；高速冷凍離心機(SORVALL RC 5C，USA）；CO2培養(yǎng)箱(SHELLAB2323，USA)；超凈工作臺(蘇州蘇凈集團安泰公司)；電子拉力測試機(Hounsfield H25KSS，UK）；掃描電子顯微鏡(PHILIPS ESEM-30)；60Co放射源(廣州輻照技術研究中心)。

2.3 實驗方法

2.3.1 支架材料的制作和分組 用PVA紡絲經(jīng)過手工編織形成有孔、無色透明、質(zhì)地較柔軟、具有一定韌性和彈性的條束狀支架材料。修剪成21 mm×2.4 mm×1.4 mm大小的韌帶支架材料若干條。分別經(jīng)0.1 mol/L稀鹽酸(HCL)—蒸餾水—0.1 mol/L氫氧化鈉(NaoH)—蒸餾水超聲洗滌，以徹底清除在紡絲和編織過程中黏附在纖維表面和孔隙內(nèi)的雜質(zhì)和污物。60Co（7kGy）輻照消毒滅菌后分2組：PVA組和PVA/COL組。PVA組材料種植細胞前用DMEM培養(yǎng)基充分浸泡。PVA/COL組材料種植細胞前用DMEM培養(yǎng)基浸泡，再用I型膠原蛋白膠行表面修飾。

2.3.2 支架材料的表面修飾 用（3.0±0.2）g/L鼠尾I型膠原蛋白膠（COL-I）浸泡—干燥—再浸泡行表面修飾。為了使編織材料內(nèi)部也能均勻地包被膠原蛋白，采用低溫負壓抽真空，將編織材料內(nèi)部的氣體排干凈。浸泡完成后在超凈工作臺上自然干燥，種植細胞前用DMEM培養(yǎng)基浸泡。

2.3.3 材料的細胞相容性檢測 用NIH-3T3細胞株體外培養(yǎng)、擴增后，以1×108 L-1的細胞懸液種植于PVA組和PVA/COL組支架材料上。37 ℃、體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h，待細胞貼附于支架材料后，加入含體積分數(shù)0.1的胎牛血清的DMEM繼續(xù)立體培養(yǎng)。隔天換培養(yǎng)液1次，3 d和7 d收集細胞－支架材料復合物。

取前交叉韌帶斷裂重建手術患者的ACL組織，經(jīng)患者或家屬知情同意。按照組織塊和膠原酶消化培養(yǎng)法在體外分離培養(yǎng)并擴增HACL細胞［5］。取3～5代HACL細胞懸液，以1×108 L-1的濃度種植于PVA組和PVA/COL組支架材料上，2 h后復種1次，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h，待細胞貼附于支架材料后，加入含體積分數(shù)0.1的胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液1次，3 d和7 d收集細胞－支架材料復合物。

細胞－支架材料復合物經(jīng)2.5 %戊二醛固定、常規(guī)脫水、CO2臨界點干燥、噴金、掃描電子顯微鏡（500～2000倍）對比觀察紡絲纖維編織支架材料經(jīng)I型膠原膠表面修飾前后NIH-3T3細胞株和HACL細胞在紡絲編織材料上細胞的粘附增殖情況。

2.3.4 材料的力學性能檢測 取6條編織好的支架材料充份浸泡濕潤后，在電子拉力機上以速度100 mm/min、初始長度為1 cm進行負荷—拉伸測試，記錄最大負荷、極限應力、最大應變及線性剛度力學指標，應用SPSS11.5軟件包進行分析。

3 結(jié)果

3.1 NIH-3T3細胞株和HACL細胞在支架材料上

的生長及細胞外基質(zhì)的分泌情況電鏡掃描可見支架材料表面光滑，孔徑大小不一，相互慣通，纖維縱橫交錯，呈三維連通的編織網(wǎng)狀結(jié)構；NIH-3T3細胞株和HACL細胞在PVA和PVA/COL支架材料表面和孔隙內(nèi)黏附增殖并能分泌細胞外基質(zhì)，NIH-3T3細胞株比HACL細胞生長旺盛。

3.1.1 NIH-3T3細胞株在支架材料生長情況 NIH-3T3細胞株在PVA和PVA/COL支架材料表面、孔隙內(nèi)及周邊呈卵圓形層疊、成堆、三維黏附生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，黏附在支架材料上的細胞逐漸增多，并分泌細胞外基質(zhì)。在PVA/COL支架材料上細胞黏附數(shù)量明顯增多、非常密集且分泌細胞外基質(zhì)都較在PVA支架材料上豐富，但在PVA支架材料上細胞生長形態(tài)較好，見圖1。

3.1.2 HACL細胞在支架材料的生長情況 HACL細胞在PVA和PVA/COL支架材料表面、孔隙內(nèi)呈梭形或多角形伸出偽促與支架材料粘附，隨著培養(yǎng)時間的延長，黏附在支架材料上的細胞逐漸增多并伸出偽足與支架材料黏附，有些細胞之間彼此相連成片狀或網(wǎng)狀黏附于支架材料。在編織支架材料表面及孔隙內(nèi)有較多纖維絲狀物質(zhì)，纖維絲排列紊亂，沒有規(guī)律性。HACL細胞在PVA/COL支架材料上細胞黏附數(shù)量明顯增多，在PVA支架材料上細胞生長形態(tài)較好， HACL細胞在PVA/COL支架材料上細胞外基質(zhì)分泌不明顯，見圖2。

3.2 支架材料拉力測試的負荷—拉伸曲線和應力—應變曲線具有與韌帶組織相似的非線性變化的特征，極限抗張強度達到了人前交叉韌帶的力學要求（見表1）。表1 聚乙烯醇編織支架材料的拉力測試結(jié)果

4 討論

PVA是一種水溶性高分子化合物，材料的親水性能好，具有良好的水溶性和組織相容性，力學性能強，柔韌性好，無毒性，目前廣泛應用于醫(yī)學領域。其分子鏈中的側(cè)鏈羥基可以結(jié)合黏附蛋白而對細胞具有較強的黏附作用，有利于細胞在PVA材料上黏附生長和增殖［6-7］。人體內(nèi)雖缺乏PVA降解酶，但改進制備后的PVA材料具有生物降解性［8-9］，因此可作為組織工程的應用材料。盡管PVA支架材料有很多用途，但單純的PVA對細胞的吸附能力是有限的［10］。而膠原作為韌帶組織最主要的細胞外基質(zhì)，可以促進組織的修復，對細胞的黏附、遷徙、增殖起重要作用［11-12］。有研究表明，PVA材料經(jīng)過纖維連接蛋白或多肽表面修飾后可以促進細胞的粘附［6，10，13］。

實驗使用I型膠原蛋白膠對PVA編織材料進行表面修飾，發(fā)現(xiàn)材料表面有一層膠原膜， 可以促進NIH-3T3細胞株及HACL細胞在材料表面及其孔隙內(nèi)黏附和增殖，并能分泌細胞外基質(zhì)。這可能與I型膠原為NIH-3T3細胞株及HACL細胞提供了更多的結(jié)合位點有關［14-15］。

用編織技術構建組織工程ACL支架材料是目前發(fā)展趨勢之一。編織材料可以較好地模擬ACL纖維走向，可改善力學性能。兩端骨隧道部分和關節(jié)內(nèi)部分的編織纖維可以形成不同的孔徑結(jié)構，有利于新生組織長入，為韌帶血管化和再生創(chuàng)造了條件［16-19］。

本實驗用PVA紡絲纖維編織韌帶支架材料，其負荷—拉伸曲線與人ACL的相似，且細胞相容性好。但與人ACL相比，還不能滿足體內(nèi)移植的力學要求。這可能與PVA紡絲纖維的纖度、直徑、編織材料孔徑結(jié)構、孔隙率、編織的角度、纖維的松緊度等因素有關。Helen等［20］研究提示，使用纖度較低和直徑較細的纖維，有助于提高支架材料力學性能。這可能由于降低纖維纖度和直徑后，單位體積內(nèi)通過的纖維數(shù)量增加，從而提高其力學性能。另外，纖維數(shù)量增加后可以提高支架材料的表面積，有利于種子細胞在支架材料上黏附和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。

選擇合適的種子細胞是組織工程關鍵之一［21］。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，HACL細胞作為韌帶的結(jié)構和功能單位，在體外培養(yǎng)時可以較好地保持韌帶細胞表型，分泌I、III型膠原蛋白能力強，具備了作為組織工程前交叉韌帶種子細胞的一些條件［22］。但HACL細胞在體外培養(yǎng)時細胞增殖相對緩慢且容易老化，如能解決這些問題，HACL細胞不失為理想的種子細胞。

COL-I可促進NIH-3T3細胞株和HACL細胞在PVA編織材料上黏附、增殖［18］。COL-I促進NIH-3T3細胞株分泌細胞外基質(zhì)，但對HACL細胞作用不明顯，原因有待進一步研究。NIH-3T3細胞株和HACL細胞在PVA/COL支架材料上細胞生長形態(tài)不如PVA支架材料上好，這可能與I型膠原膠的pH值影響有關。細胞生長適宜的pH值是7.2～7.4，而膠原蛋白是一種酸溶性蛋白，其溶液隨濃度增大、pH升高有明顯的聚集行為［23］。當膠原膠pH值超過6.0，膠原膠就會凝集如凝膏狀，使之難以與材料進行表面修飾。

I型膠原可促進NIH-3T3細胞株和HACL細胞在聚乙烯醇紡絲纖維編織支架材料表面和孔隙內(nèi)黏附、增殖，可促進NIH-3T3細胞株分泌細胞外基質(zhì)。但I型膠原膠對材料的修飾方法尚需進一步完善，如償試降低Ⅰ型膠原膠的濃度來提高pH值，減低因pH值因素對細胞不良的刺激。聚乙烯醇紡絲纖維編織材料形成具有孔徑結(jié)構的三維支架，具有一定的力學性能和細胞相容性，有望成為一種組織工程前交叉韌帶支架材料。