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摘要：重組腺病毒是常用的基因轉(zhuǎn)移載體,本文介紹一種對腺病毒基因組進(jìn)行反向遺傳改造的策略。擬在維持基因編碼蛋白氨基酸序列不變的前提下,突變?nèi)コ亟M人5型腺病毒Ad5GFP基因組的PmeI酶切位點(diǎn)。軟件分析腺病毒質(zhì)粒pAd5GFP序列,選擇限制性內(nèi)切酶BamHI將pAd5GFP切割為大小11.7和24.6kb兩個片段,24.6kb大片段自身環(huán)化形成一個質(zhì)粒pAd5GB,PmeI位于其上。PmeI/AscI雙酶切pAd5GB質(zhì)粒,產(chǎn)生2.4kb和22.2kb兩個片段;在引物部位引入突變的PmeI位點(diǎn)(由gtttaaac突變?yōu)間tttaaaT),PCR擴(kuò)增得到兩端各延長30bp的上述2.4kb片段,與22.2kb片段進(jìn)行Gibson組裝,轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞,得到pAd5GBXP質(zhì)粒。BamHI酶切pAd5GBXP,堿性磷酸酶處理,與11.7kb片段連接,還原得到腺病毒質(zhì)粒pAd5GXP。PacI線性化pAd5GXP質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析證明Ad5GXP基因組不含有PmeI位點(diǎn)。研究結(jié)果說明將酶切連接與DNA組裝技術(shù)相結(jié)合,能夠方便靈活地對腺病毒基因組進(jìn)行突變改造。

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