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摘要：Argonaute（AGO）蛋白家族在小RNA誘導(dǎo)的基因沉默中發(fā)揮重要作用。基于家蠶基因組測序發(fā)現(xiàn)的AGO蛋白編碼序列,選擇Bm AGO2為目標(biāo)蛋白質(zhì),制備該蛋白質(zhì)的單克隆抗體,為進(jìn)一步研究其介導(dǎo)的miRNA靶基因以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。通過分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,篩選出Bm AGO2抗原表位區(qū)aAGO2,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段,構(gòu)建重組表達(dá)載體p ColdⅡ-aAGO2原核表達(dá)aAGO2蛋白,以純化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾臟,將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合。以HAT選擇培養(yǎng)基及間接ELISA法篩選陽性克隆,經(jīng)Western blotting和免疫沉淀檢測,獲得2株生長狀態(tài)好、能分泌高效價(jià)抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株I5-A9和E1-3。經(jīng)抗體亞型檢測后,選擇細(xì)胞株I5-A9進(jìn)行大量培養(yǎng),菌液注射小鼠腹腔制備的腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀及Protein A/G親和層析純化,獲得了純度較高的Bm AGO2單克隆抗體。利用獲得的抗體免疫共沉淀家蠶卵巢培養(yǎng)細(xì)胞Bm N以及家蠶5齡幼蟲的內(nèi)源Bm AGO2蛋白,從分離的結(jié)合RNA檢測到小RNA被顯著富集,表明成功制備了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2單克隆抗體并分離BmAGO2結(jié)合的RNA。

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