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摘要：目的利用迭代飽和突變技術進-步提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰轉移酶雙突變體DBATG38R/F301V的活性;通過丙氨酸掃描確定DBAT活性中心的重要位點.方法利用迭代飽和突變技術在現(xiàn)有雙突變體DBAT^G38R/F301V的基礎上對Ser^396進行半飽和突變,篩選對10-去乙酰紫杉醇（DT）催化活性提高的突變體;對獲得的高活性突變體蛋白進行催化DT的最適溫度和最適pH測定;在最適pH條件下,將其分別用最適反應溫度和0℃溫育6h,考察該蛋白的熱穩(wěn)定性;采用生物信息學方法分析活性提高的分子機制.對DBAT底物結合區(qū)域尚未進行分析的幾個氨基酸進行丙氨酸掃描研究,分析這些位點在DBAT催化10-DAB和DT過程中的作用.結果獲得了三突變體DBAT^G38R/F301V/S396I,其催化DT的活性為DBAT^G38R/F301V的1.6倍,該蛋白催化DT的最適條件為37.5℃,pH7.5;該蛋白在37.5℃靜置6h后催化DT的活力為初始值的30%,在0℃靜置6h后為初始值的70%;丙氨酸掃描結果顯示,Asn^45在DBAT催化10-DAB和DT時都非常重要,而Asn^42、Glu^350、Glu^355和Lys^389位點對催化10-DAB的影響更大.結論將活性口袋內的親水性氨基酸向疏水性氨基酸突變可能有利于DBAT對DT的催化,但氨基酸側鏈的長度和空間構型也是影響催化活性的重要因素;發(fā)現(xiàn)Asn^45可能是-個潛在的DBAT催化或底物結合位點.

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