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摘要：研究旨在構(gòu)建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒,探索研制新型抗菌制劑,為利用基因工程技術(shù)防治奶牛乳房炎提供重要材料。根據(jù)GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank號(hào):NM_180999.1)設(shè)計(jì)引物,從奶牛乳腺上皮細(xì)胞中RT-PCR擴(kuò)增Lyz基因編碼序列,將其克隆到攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白通用型表達(dá)載體pEGFP-N1中測(cè)序。重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Lyz經(jīng)AseI+HindIII雙酶切除CMV啟動(dòng)子,將奶牛乳腺特異性表達(dá)β-乳球蛋白基因(BLG)啟動(dòng)子同源重組替換到AseI和HindIII酶切位點(diǎn),構(gòu)建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)、人腎臟上皮細(xì)胞(HEK293T),熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明,重組表達(dá)質(zhì)粒pBLG-EGFP-N1-Lyz測(cè)序結(jié)果與目的片段長(zhǎng)度相符,轉(zhuǎn)染至BMEC細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞,在奶牛乳腺上皮細(xì)胞觀察到綠色熒光,HEK293T細(xì)胞未觀察到綠色熒光,奶牛Lyz基因乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

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