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摘要：目的原核表達(dá)腸道病毒68型(enterovirus D68,EV—D68)表面結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3,分析其親和力和結(jié)合力,得到具備高結(jié)合力的、可結(jié)合特異性記憶性B細(xì)胞的EV-D68病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白。方法采用PCR法擴(kuò)增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表達(dá)載體pGEX-5X-1,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,轉(zhuǎn)化到工程菌Rosetta(DE3)pLy中,異丙基硫代半乳糖苷(i-sopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)的重組蛋白形成包涵體,經(jīng)超聲洗滌、透析復(fù)性;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel immunosorbent,SDS-PAGE)電泳、westem-blot鑒定重組蛋白;競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(eIlzyme linked immunosorbent assay,EusA)檢測(cè)蛋白VP2、VP3的蛋白活性和親和力;藻紅蛋白熒光素(phycoeryth面,PE)標(biāo)記VP2和VP3重組蛋白,結(jié)合CD19-APC、CD27-nTc抗體,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VP2、VP3蛋白結(jié)合特異性記憶性B細(xì)胞的情況。結(jié)果成功構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,通過(guò)雙酶切鑒定及測(cè)序分析,確認(rèn)表達(dá)載體構(gòu)建正確,通過(guò)表達(dá)純化,成功獲得EV-D68的VP2、VP3蛋白,SDS-PAGE電泳灰度掃描顯示,VP2蛋白的純度可達(dá)80%,VP3蛋白的純度可達(dá)75%;經(jīng)westem-blot和EusA鑒定,均有抗原特異性;通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)EusA檢測(cè),VP2親和力常數(shù)為2.7×10^7M^-1,為中等親和力;VP3親和力常數(shù)為3.25×10^6M^-1,為低親和力;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)到病毒攻擊小鼠后脾臟細(xì)胞中的特異性記憶性B細(xì)胞。結(jié)論成功原核表達(dá),復(fù)性純化得到EV-D68VP2、EV-D68VP3蛋白,兩個(gè)蛋白均具有較強(qiáng)的抗原特異性,利用流式細(xì)胞儀能檢測(cè)到特異性記憶性B細(xì)胞。最終獲得了具有較強(qiáng)結(jié)合能力,可用于分選抗原特異性記憶性B細(xì)胞的EV-D68表面結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3,為研究VP2、VP3蛋白的中和抗原表位及其廣譜中和抗體的分選檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。

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