大鼠shRNA-Slfn1重組腺病毒載體的構建與鑒定
摘要:目的:構建大鼠睡眠因子1(Slfn1)基因的發夾狀RNA質粒,并進行腺病毒載體包裝。方法:根據Rat slfn1基因的轉錄本設計并合成3個干擾RNA靶點ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3),并將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列,連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體(p DKD-CMV-U6-shRNA)的U6啟動子下游,替換掉原來的ccd B基因;利用Admax系統,將3種目的穿梭質粒分別與腺病毒骨架質粒共轉染到HEK293細胞中重組獲得病毒后進行小量擴增及病毒滴度測定;利用Slfn1過表達腺病毒質粒中目的基因攜帶Flag標簽,通過Western Blot檢測Slfn1過表達腺病毒質粒與靶點質粒共轉染293T細胞中Flag表達,觀察靶點質粒對Slfn1表達的影響。結果:經菌落PCR鑒定獲得陽性克隆并測序驗證正確,表明構建質粒成功;腺病毒包裝ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3)的病毒滴度分別為1.0×10^14ifu/L,2.5×10^14ifu/L,6.3×10^13ifu/L,Western Blot證實ShRNA-Slfn1(1)及ShRNA-Slfn1(3)能顯著降低轉染293T細胞中Flag的表達,確定shRNA-Slfn1(1)及shRNA-Slfn1(3)為目的質粒。結論:成功構建了大鼠shRNA-slfn1的重組腺病毒載體。
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