大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG質粒的構建、基因結構分析及鑒定
摘要：目的：大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG基因重組表達質粒的構建及其基因結構分析。方法：通過UCSC（http：//genome.ucsc.Edu/）分析大鼠瞬時受體電位通道4（TRPC4）及其家族基因組結構,并通過NCBI確定了TRPC4的蛋白結構域,通過Bio GPS（http：//biogps.org/#goto=welcome）分析其表達模式;PCR擴增大鼠TRPC4蛋白編碼區域（CDS）,并通過限制性內切酶與穿梭載體pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG進行連接,其產物轉化細菌感受態細胞;挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定,并對陽性克隆進行測序驗證,測序正確的克隆即為目的質粒,命名為pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG;將該質粒轉染HEK293細胞進行腺病毒包裝,并命名為Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG,通過Western blot驗證蛋白的表達。結果：生物學分析發現TRPC4蛋白保守的TRP-2、ANK及TRP結構域,通過Bio GPS分析發現TRPC4在杏仁核和海馬中表達明顯,在血管內皮細胞中也有表達;PCR克隆獲得3 000 bp的TRPC4 CDS序列,CDS被亞克隆到表達載體pDOV-mCMVMCS-EGFP-3FLAG中,酶切鑒定及測序驗證正確;進行腺病毒包裝后的病毒可以在HEK293細胞中表達TRPC4-EGFP-3FLAG融合蛋白,Western blot證實其為含flag標簽的蛋白且大小為128 KDa。結論：成功構建了大鼠TRPC4的腺病毒表達載體Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG。
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