逆轉錄病毒介導的穩定表達E4orf1和綠色熒光蛋白的胎肝竇內皮細胞株的建立
摘要：目的：為構建優化的內皮細胞用于造血干細胞（HSCs）的支持培養,通過逆轉錄病毒載體系統建立穩定表達腺病毒E4區開放讀框1（E4orf1）和綠色熒光蛋白（GFP）的人胎肝竇內皮細胞（HFLSECs）株。方法：利用Plat-A細胞將質粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分別包裝為逆轉錄病毒,共同感染HFLSECs,將原代培養的HFLSECs和轉基因的HFLSECs分別在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培養基中培養,以測試最適藥物篩選濃度,藥篩1周后通過流式細胞分選獲得穩定轉染E4orf1的GFP＋HFLSECs（E4orf1-GFP/HFLSECs）。通過密度梯度離心法從臍帶血中分離單個核細胞,利用免疫磁柱分選獲得CD34＋造血干/祖細胞（HSPCs）,以E4orf1-GFP/HFLSECs作為飼養層聯合SCF、TPO、Flt-3L等3種基礎造血相關因子進行體外擴增和半固體造血細胞集落培養。結果：0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d內即能完全殺死HFLSECs,而轉基因的HFLSECs可以正常存活,以此藥物濃度加壓篩選1周,后續通過流式分選GFP陽性細胞,陽性率為90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs飼養層支持下,人臍帶血來源的CD34＋細胞15 d擴增了360倍,是單純細胞因子懸浮培養組的2.2倍,且擴增后的HSPCs在體外仍具有多種造血集落形成能力。結論：該細胞株的建立將為構建造血干細胞體外培養體系及研究造血細胞的發育分化提供適宜的微環境。
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